Un protocolo para el aislamiento y la activación de las espermátidas de varón C. elegans Se describe aquí. Cortar el extremo posterior de esperma macho libera. Las espermátides se puede activar mediante la adición de la proteasa.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma
En este artículo
Resumen
Resumen
Los varones y hermafroditas son las dos formas sexuales se encuentran naturalmente en el nematodo C. elegans. Los espermatozoides son ameboides producida tanto por hombres y hermafroditas. En la primera fase de la gametogénesis, las células germinales de los hermafroditas se diferencian en cantidad limitada de espermatozoides - alrededor de 300 - y se almacenan en una pequeña "bolsa" llama la espermateca. Más tarde, los hermafroditas producen continuamente ovocitos 1. Por el contrario, los machos producen exclusivamente espermatozoides durante toda su vida adulta. Los machos producen espermatozoides tanto que representa> 50% del total de células en un típico gusano de dos adultos. Por lo tanto, aislar los espermatozoides de los machos es más fácil que de la de los hermafroditas.
Sólo una pequeña proporción de los hombres son naturalmente generado debido a la espontánea no disyunción del cromosoma X 3. Cruzando hermafroditas con los hombres o, más convenientemente, la introducción de mutaciones que dan lugar a él (alta incidencia de varones) fenotipo son algunas de las estrategias a través del cual se puede enriquecer a la población masculina 3.
Los machos pueden distinguirse fácilmente de los hermafroditas mediante la observación de la morfología de la cola 4. La cola es hermafrodita en punta, mientras que la cola masculina se completa con las estructuras de apareamiento.
Corte de la cola libera gran cantidad de esperma almacenado en el interior del aparato reproductor masculino. La disección se realiza bajo un microscopio estéreo con agujas de calibre 27. Desde espermátidas no están físicamente conectados con cualquier otra célula, la presión hidráulica expulsa contenido interno del cuerpo masculino, incluyendo dos espermátidas.
Los machos son directamente disecados en una pequeña gota de "Medio de esperma". Espermátidas son sensibles a la alteración en el pH. Por lo tanto, HEPES, un compuesto con una buena capacidad de amortiguación se utiliza en los medios de esperma. La glucosa y otras sales presentes en los medios de comunicación ayudan a mantener el esperma presión osmótica para mantener la integridad de los espermatozoides.
Post-meiótica diferenciación de las espermátidas en espermatozoides se denomina espermiogénesis o la activación de los espermatozoides. Batidos 5, 6 y Nelson mostraron con anterioridad que espermátidas redondas pueden ser inducidas a diferenciarse en espermatozoides mediante la adición de diferentes compuestos como la activación de pronasa E. Aquí se demuestra in vitro espermiogénesis de C. elegans espermátidas con pronasa E.
Espermiogénesis éxito es pre-requisito para la fertilidad y por lo tanto, los mutantes defectuosos en la espermiogénesis son estériles. Hasta ahora, varios mutantes han demostrado que son defectuosos específicamente en el proceso de espermiogénesis 7. Anomalía encontrada durante la activación in vitro de la novela de SPE (espermatogénesis defectuosa) mutantes que nos ayuden a descubrir más jugadores que participan en este evento.
Protocolo
1) El enriquecimiento de la población masculina
- Dependiendo de la necesidad de experimentación, un gran número de hombres se puede obtener mediante el empleo de una de las siguientes estrategias:
- gran población de hombres de tipo salvaje se puede obtener mediante el cruce 5 machos de tipo salvaje y hermafroditas 1 en un pequeño jardín de OP50 cabeza de serie en el centro de la placa de NGM. Aproximadamente el 50% de la generación siguiente serán hombres de tipo salvaje.
- él-5 (e1490) o lo-8 (e1489) hermafroditas lanzar gran cantidad de hombres. lo-5 y lo-8 machos son fértiles y no hay ningún defecto evi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Además de analizar mutantes Espe, este protocolo tiene otras aplicaciones importantes, como el análisis de la morfología del espermatozoide con el envejecimiento. Espermátides y espermatozoides aislados utilizando este protocolo puede ser utilizado en otros experimentos posteriores, tales como, la inmunotinción de tipo salvaje y el espermatozoide mutante 8, 9, motilidad de los espermatozoides en las diapositivas 10, las mediciones fisiológicas 9, 11, o incluso la inseminación artificial .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Samuel Ward, Diane C. batidos y Gregory Nelson por ser pionero en esta técnica. Damos las gracias a Pavan Kadandale y Geldziler Brian de videos que muestran los espermatozoides activados, los miembros del laboratorio de Singson útil para los debates; CGC para las cepas y los NIH por su apoyo a través de la subvención (R01HD054681).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de tuberculina | BD Biosciences | 309623 | Jeringa: 1 ml, aguja: 27G X ½ in |
| Pluma para Pap | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| Portaobjetos VWR VistaVision HistoBond | VWR international | 16004-406 | Dimensión: 75X25X1mm |
| Cubreobjetos | VWR international | 48366045 | |
| Proteasa | Sigma-Aldrich | P-6911 |
Referencias
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Explorar más artículos
