Clathrin endocitosis mediada depende de las proteínas adaptador que coordinar la selección de carga y montaje capa clatrina. A continuación se describen los procedimientos para el estudio del adaptador de clatrina interacción física y imágenes de células vivas enfoques, utilizando como modelo la levadura endocítica Sla1p adaptador de proteínas.
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Artículo de método
In vivo e in vitro de adaptador de clatrina-Interacción
En este artículo
Resumen
Resumen
Una importante vía endocítica se inicia con la formación de vesículas de clatrina recubiertos (CCV) que transportan cargas de la superficie celular de endosomas 1-6. CCV se distinguen por una red poliédrica de clatrina que cubre la membrana de la vesícula y sirve como un andamio mecánico. Abrigos de clatrina se ensamblan en la formación de vesículas de clatrina triskelia individuales, la forma soluble de clatrina compuesto por tres subunidades de la cadena pesada y tres de luz 7,8. Debido a que el triskelion no tiene la capacidad de unirse a la membrana directamente, clatrina vinculante adaptadores son fundamentales para vincular la red de clatrina que forman la membrana a través de la asociación con los lípidos y / o proteínas de membrana 9. Adaptadores también transmembrana paquete de proteínas de carga, como los receptores, y pueden interactuar entre sí y con otros componentes de la formación CCV maquinaria 9.
Más de veinte adaptadores de clatrina se han descrito, hay varios implicados en la endocitosis mediada por clatrina y otros localizar a la red trans Golgi o endosomas 9. Con la excepción de HIP1R (levadura Sla2p), todos los adaptadores de clatrina conocidos se unen al dominio N-terminal-hélice de la cadena pesada de clatrina 9. Adaptadores de clatrina son proteínas modular que consta de dominios cruzados conectados por conectores flexibles no estructurados. Dentro de estas regiones enlazador, a corto motivos de unión a mediar en la interacción con la clatrina N-terminal de dominio o de otros componentes de la formación de vesículas maquinaria 9. Dos distintas clatrina motivos de unión se han definido: la caja de clatrina y la caja de W-9. El consenso de clatrina-box secuencia se había definido como L [L / I] [D / E / N] [I / F] [D / E] 10, pero las variantes se han descubierto posteriormente 11. El W-box se ajusta a la secuencia de PWxxW (donde x es cualquier residuo).
Sla1p (sintética letal con la proteína de unión actina-1) fue originalmente identificado como una proteína actina asociados y es necesaria para la estructura normal del citoesqueleto de actina y la dinámica en los sitios de endocitosis en células de levadura 12. Sla1p también se une a la señal de NPFxD clasificación endocítica y es fundamental para la endocitosis de la carga que lleva la señal de NPFxD 13,14. Más recientemente, se demostró que Sla1p unen clatrina a través de un motivo similar a la caja de clatrina, LLDLQ, denominada variante de clatrina-box (VCB), y para funcionar como un adaptador de endocitosis clatrina 15. Además, Sla1p ha convertido en un marcador ampliamente utilizado para la capa de endocítica en los estudios de microscopía de fluorescencia de células vivas 16. Aquí se utiliza Sla1p como un modelo para describir los enfoques de los estudios de interacción clathrin adaptador. Nos centramos en la microscopía de fluorescencia de células en vivo, GST-pull down, y los métodos de co-inmunoprecipitación.
Protocolo
1. Incorporación de una etiqueta de las buenas prácticas agrarias y marcador de selección en el gen SLA1
Aplicar el método Longtine 17, a fin de fusionar una etiqueta de las buenas prácticas agrarias directamente en el extremo 3 'del marco de lectura abierta del gen SLA1 (Sla1p C-terminal) y al mismo tiempo marca el gen con la E. coli kan r gen que permite la selección G418.
- Generar un fragmento de ADN por PCR utilizando como molde el plásmido pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 y los siguientes cebadores: adelante, 5'-CA AGG CAA CCG AAC ATA TTC AAT ACT GCA GCT TCA AAT CCG TTT GGA CGG ....
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Discusión
Clathrin vesículas con cubierta (CCV) participan en la endocitosis y el transporte de la red trans Golgi y los endosomas, las vías de conservación que son fundamentales para la biología de las células eucariotas. Los enfoques descritos en este documento los métodos son útiles para estudiar los mecanismos moleculares responsables de la formación de CCV, en particular, las interacciones entre las proteínas y el adaptador de clatrina. De fusión GST-afinidad de proteínas y ensayos de inmunoprecipitación co-permiten.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
DF con el apoyo de una Puentes NSF para la beca de doctorado. El microscopio usado en este trabajo es apoyado en parte por el microscopio de imagen de infraestructura de red central de la concesión de Colorado State University. El trabajo de los adaptadores de clatrina en el laboratorio del autor s con el apoyo de la CSU fondos iniciales y la adjudicación Asociación Americana del Corazón 09SDG2280525 a SD
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Materiales
| Material | Empresa | ||
|---|---|---|---|
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| QuickChange-XL mutagénesis dirigida kit | Stratagene | ||
| cóctel de inhibidores de la proteasa | Sigma |
Referencias
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- C....
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Reimpresiones y permisos
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