Artículo de método

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

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DOI:

10.3791/2365

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3 de enero de 2011

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1National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2School of Life Science, Xiamen University

En este artículo

Resumen

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos de Plasmodium yoelii Y es aplicable a otros parásitos de roedores malaria.

Resumen

Variación en la respuesta a los medicamentos antimaláricos y en la patogenicidad de los parásitos de la malaria es de importancia biológica y médica. Mapas de los vínculos ha llevado a la identificación exitosa de los genes o loci subyacente varios rasgos en los parásitos del paludismo de los roedores y los humanos 1-3 4-6. El parásito de la malaria Plasmodium yoelii es una de las especies de malaria muchos aislado de roedores silvestres de África y ha sido adaptado para crecer en el laboratorio. Esta especie se reproduce muchas de las características biológicas de los parásitos del paludismo humano; marcadores genéticos como los microsatélites y marcadores de fragmentos amplificados polimorfismo en la longitud (AFLP) también se han desarrollado para el parásito de 7-9. Así, los estudios genéticos de los parásitos del paludismo de roedores se pueden realizar para complementar la investigación sobre el Plasmodium falciparum. En este sentido, demostrar las técnicas para la producción de un cruce genético de P. yoelii que fueron los primeros por primera vez por los Dres. David Walliker, Richard Carter, y sus colegas de la Universidad de Edimburgo 10.

Cruces genéticos de P. yoelii y otros parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo mediante la infección de ratones Mus musculus con un inóculo que contiene gametocitos de dos clones genéticamente distintas que se diferencian en fenotipos de interés y permitiendo que los mosquitos que se alimentan de los ratones infectados cuatro días después de la infección. La presencia de gametocitos masculinos y femeninos en la sangre del ratón es microscópicamente confirmados antes de alimentar. Dentro de las 48 horas después de comer, en el intestino medio del mosquito, los gametocitos haploides se diferencian en gametos masculinos y femeninos, fertilizar, y forma un cigoto diploide (Fig. 1). Durante el desarrollo de un cigoto en un oocineto, meiosis parece ocurrir 11. Si el cigoto se deriva a través de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos parásitos genéticamente distintos, los intercambios genéticos (recombinación cromosómica y cross-overs entre las cromátidas no hermanas de un par de cromosomas homólogos;. Fig. 2) puede ocurrir, resultando en la recombinación de material genético en loci homólogos. Cigoto experimenta dos divisiones nucleares sucesivas, dando lugar a cuatro núcleos haploides. Un oocineto más se convierte en un ooquiste. Una vez que el ooquiste madura, miles de esporozoitos (la descendencia de la cruz) se forman y se liberan en hemoceal mosquito. Esporozoitos se cosechan a partir de las glándulas salivales y se inyecta en un nuevo huésped murino, donde el desarrollo de la etapa pre-eritrocítica y eritrocítica se lleva a cabo. Formas eritrocíticas se clonan y se clasifican con respecto a los caracteres distintivos de las líneas parentales antes de mapeo de ligamiento genético. Control de las infecciones de los distintos clones de los padres se llevan a cabo en la misma forma que la producción de un cruce genético.

Protocolo

Técnicas de asepsia deben ser aplicadas a todos los materiales que serán administrados a los animales para evitar la introducción accidental de agentes infecciosos exógenos en los ratones que se pueden confundir los resultados experimentales.

1. La infección de ratones de laboratorio con parásitos de la malaria el estadio en sangre

  1. A temperatura ambiente, descongelar dos viales que contienen la sangre congelada parásitos de la malaria etapa que se cruzaron. En este ejemplo, dos cepas de roedores parásito de la malaria utiliza son el Plasmodium yoelii yoelii y nigeriensis Plasmodium yoelii.
  2. Adaptarse a una jeringa con un calibre 22-30 (G) la aguja y elaborar 400 l de agua estéril, farmacéutica grado PBS (pH 7,4).
  3. Utilizando la misma jeringa, elaborar 100 L de la sangre infectada descongelado; invierta la jeringa hacia arriba y abajo hasta que el contenido es homogéneamente mezclado. (Opcional: una pipeta se puede utilizar para la transferencia de PBS y la sangre infectada en un tubo de recogida antes de transferir a una jeringa para inyección).
  4. Inyectar 200 uL de parásito que contiene la solución directamente en el peritoneo de un ratón. Cuando termine, deseche la jeringa en un contenedor de objetos punzantes. (Véase también materiales complementarios para el mantenimiento de los ratones de laboratorio). En general, el tamaño estándar de la inoculación es de entre 100 a 500 l, en función de los niveles de infecciones del parásito en los materiales congelados original.
  5. Inyectar las dos cepas de parásitos que se cruzaron en dos ratones cada uno. Los ratones se convertirá en positivo microscópicamente 3 a 5 días después de las inyecciones. Al llegar a parasitemias entre 1-5%, continúe con el siguiente paso.

2. Infección mixta de clonar ratones

  1. Antes de la infección clon mixto, recoger la sangre de la cola de los dos ratones donantes infectados con cepas de parásitos diferentes para el examen microscópico de frotis teñidos con Giemsa diluir la sangre (Fig. 3), y para la medición de la densidad de glóbulos rojos (ver material complementario para los procedimientos detallados) .
  2. Calcular el volumen de una solución salina fisiológica (1,5% w / v de citrato trisódico dihidrato, 0.85% w / v de cloruro de sodio) y la sangre de ratón para producir una mezcla de inóculo, utilizando la parasitemia y el rojo las mediciones de densidad de células sanguíneas obtenidas anteriormente.
  3. Ajustar la solución de los parásitos a una concentración final de un millón de células rojas de la sangre infectada por 100μl.
  4. Combine la sangre infectada de los dos donantes en una proporción de 1:1 para obtener un inóculo mixto clon. Cuando los dos clones parentales difieren en la tasa de crecimiento, ajustar las proporciones de una. De más rápido crecimiento de los padres a un clon de crecimiento más lento de los padres a 01:02 o 01:05
  5. Inyectar 100 l de la muestra mezclada en el peritoneo de los ratones de la infección. (Véase también el paso 3.9 para determinar el número de ratones que se inyecta)
  6. Usando este método, infectar a dos ratones cada uno con las cepas parentales individuales. Las infecciones de un solo clon permitirá la determinación de la transmisión con éxito de las dos cepas parentales.

3. Los mosquitos de alimentación

  1. Prepare tres cajas que contienen 300 a 500 adultos (hombres y mujeres) los mosquitos Anopheles stephensi cada uno, edad 5-7 días después de la aparición de pupas. Los contenedores están cubiertos con una red segura por un plástico o una tapa de metal. Dos jaulas para alimentarse de clones parentales, la tercera jaula es para la preparación de un cruce genético.
  2. A partir cuatro días después de la infección mixta-clone, preparar Giemsa frotis finos de sangre de la cola de los ratones infectados.
  3. Examinar los frotis en el microscopio de barrido por lo menos 50 campos microscópicos con un aumento de 1000x y determinar si gametocitos masculinos y femeninos están presentes.
  4. Gametocitos masculinos y femeninos son reconocibles por la presencia de grandes gránulos y grandes vacuolas (Fig. 3). Gametocitos masculinos y femeninos tienen un citoplasma de color rosa y azul, respectivamente. Si gametocitos presentes, siga el Paso 3.6.
  5. Si gametocitos están ausentes, mantener la vigilancia diaria hasta que aparezcan. Si gametocitos presentes, continuar con el siguiente paso.
  6. Inyectar 50 L de cóctel de fármacos anestésicos que contienen 33 mg / ml de ketamina y de 3 mg / ml de xilazina en el peritoneo de un ratón para anestesiar a cada ratón infectado (por cada 20 gramos de peso corporal del ratón). Última dosis de ketamina y xilazina es de 82.5 y 7.5 mg / Kg, respectivamente.
  7. Coloque el ratón boca abajo en la parte superior de una jaula que contenía un adulto mosquitos Anopheles stephensi que han sido privadas de abastecimiento de azúcar de 24 horas y permitir a los mosquitos para alimentarse durante 30 minutos sin interrupción.
  8. Mantener a los mosquitos en un insectario en condiciones normales (temperatura se mantiene entre 24-26 ° C; ver también métodos complementarios para el mantenimiento del laboratorio de los mosquitos).
  9. Utilice un ratón infectado por cada 50 a 100 hembras de los mosquitos. La eutanasia a los ratones por dislocación cervical inmediatamente después de la alimentación, mientras que los ratones están todavía bajo la anestesia.

4. Mosquito disección Midguts y ooquistes Contando

  1. Nueve días después de la alimentación, los mosquitos se examinarán de ooquistes en el intestino del insecto. La presencia de ooquistes en los mosquitos que se alimentan de un solo clon de ratones infectados indica que los gametocitos de las dos cepas parentales son infecciosos.
  2. Para la disección de un intestino medio del mosquito, use un aspirador conectado a un pequeño recipiente para recoger 5 a 10 mosquitos infectados de la jaula.
  3. Utilizando el gas CO 2, anestesiar a los mosquitos y transferirlos a un plato de Petri de vidrio en el hielo. Separados y desechar los mosquitos machos. Las antenas de los machos son notablemente más tupidas, en comparación con las hembras.
  4. Llenar dos jeringas con PBS y en forma con calibre 26 de media pulgada (G ½) agujas. Depósito de 100 l de PBS a partir de una jeringa en un portaobjetos de vidrio.
  5. La transferencia de 5 a 10 hembras de los mosquitos anestesiado sobre la gota de PBS y colocar la placa en un microscopio de disección.
  6. Utilizando las mismas agujas, quitar las alas cada mosquito y las piernas, luego, manteniendo al insecto en el abdomen, tórax y posterior, retire el cuerpo de otro hasta el intestino medio, de color blanco en forma de saco del cuerpo, se libera. Separar el intestino medio y desechar el resto del cuerpo.
  7. Añadir más PBS en el intestino medio, si las diapositivas se seca. El intestino medio se degeneran si deja secos. Coloque un cubreobjetos sobre el intestino medio.
  8. Examinar el intestino medio con un microscopio óptico con un aumento de 100x. Cuente el número de ooquistes en cada intestino medio (Fig. 3). Ooquistes son reconocibles como de pared gruesa estructuras circulares que se encuentran en la superficie externa de la midguts.
  9. Cuando haya terminado, disponer de jeringas, agujas, y se deslizan en un recipiente de objetos punzantes.
  10. Si los ooquistes están ausentes en el intestino medio, los mosquitos se alimentan con ratones infectados con el mayor número de gametocitos y dar más tiempo de alimentación. La temperatura es crítica para este paso. Asegúrese de que la temperatura se ha fijado en 24 a 26 ° C.

5. Recogida de esporozoítos de los mosquitos por centrifugación

  1. Prepare los tubos de recogida de esporozoito de la siguiente manera: cortar la tapa de un tubo de centrífuga limpio de 0.5 ml y un agujero (0.1-0.2 mm de diámetro) en la parte inferior del tubo con una aguja de 19 G flameado.
  2. Llene 1 / 3 del tubo con lana de vidrio. Introduzca el tubo de filtro en un tubo de recogida de 1,5 ml (un tubo es suficiente para la cosecha de esporozoitos ~ 100 mosquitos)
  3. Sobre la alimentación después de 17 días, recoger los mosquitos (paso 4) de las jaulas en un recipiente pequeño con un aspirador.
  4. El uso de CO 2 del gas para anestesiar a los mosquitos.
  5. Separados de las hembras de los mosquitos machos. La transferencia de los mosquitos hembras anestesiados desde el contenedor a un plato de Petri de vidrio en el hielo.
  6. Preparar dos jeringas con agujas de 26 G ½ lleno de PBS. Depósito de 100 l de PBS a partir de una jeringa en un portaobjetos de vidrio.
  7. La transferencia de los mosquitos en un portaobjetos de microscopio. Quitar la cabeza de los mosquitos, las alas, piernas y abdomen, debajo de un microscopio de disección.
  8. Utilizando unas pinzas de punta fina transferir el tórax en 0,5 ml de PBS en un homogeneizador de 1,5 mL (mortero). Guarde el tórax en el hielo (esporozoito permanece infectante durante 2-3 h).
  9. Homogeneizar el tórax en el hielo para liberar esporozoitos de las glándulas salivales (ver Figura 3), y la transferencia de los lisados ​​(homogeneizados) en el tubo lleno de lana de vidrio (Paso 5.1 a 5.2) usando una pipeta de vidrio.
  10. Centrífuga de 10 a 20 segundos a 1000 rpm a temperatura ambiente.
  11. Recoger el flujo a través de (la suspensión de esporozoito purificado) con una jeringa con una aguja de 22-30 G. (Opcional: caída de 10 a 50 L de la corriente a través de una lámina de microscopio, coloque una hoja de cubierta y visualizar los esporozoitos vivir bajo un microscopio óptico estándar, 400X ampliación, véase también la Fig. 3)
  12. Inyectar ip 0,1-0,5 ml de la suspensión de esporozoitos en ratones (hasta 200.000 parásitos pueden ser cosechados de un mosquito, ver ref 12). En un caso de éxito, el animal se infectan 72 horas después de una inyección.

6. La clonación de progenie con dilución limitada

  1. Setenta y dos horas después de las inyecciones de esporozoito, recoger la sangre de la cola de los dos ratones donantes infectados con cepas de parásitos diferentes para el examen microscópico después de la tinción de Giemsa de frotis de sangre delgado y para la medición de la densidad de glóbulos rojos (ver material complementario para los procedimientos detallados).
  2. Elija un ratón mostrando una parasitemia 0,1 a 1% y cuyas células rojas de la sangre infectada contener parásitos en su mayoría solo como donante para el proceso de clonación. Repita el paso 6.1 próximos días si los ratones son microscópicamente negativos. Si los animales no están infectados dentro de 14 días, repita los pasos 2 a 5 y determinar la presencia de esporozoitos en el paso 5.11).
  3. Diluir la sangre recogida en la cola de un resfriado 01:01 solución de Ringer suero de ternera y de mamíferos (2,7 mM de cloruro de potasio, cloruro de calcio 1,8 mM, 154 mM de cloruro de sodio) con el fin de alcanzar una estafaconcentración de 0,6 a 1 célula infectada rojas de la sangre por cada 100 l, y almacenar el inóculo en el hielo. De esta manera, la mayoría de los mouse persona debe recibir uno o cero parásitos.
  4. Por vía intravenosa se inyectan 100 l de sangre diluida infectados en cada uno de 50 a 100 ratones.
  5. De cinco a siete días más tarde, la pantalla de los ratones de la presencia de parásitos en el estadio de sangre mediante el examen de Giemsa frotis finos de sangre. En un experimento exitoso, el 20-50% de los ratones infectados y se mostrará la parasitemia de 0.1-5.0% después de la infección en el día 8.

7. Caracterización de la progenie con marcadores genéticos

  1. Recoge 20 a 40 l de sangre del ratón de cola en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,2 ml de solución salina fisiológica fría citrato, agitar brevemente y centrifugar durante 3 minutos a 3000 rpm a temperatura ambiente para que sedimenten las células de la sangre. Extraer el ADN de inmediato o guardar el pellet a -80 ° C.
  2. Prepare el ADN del parásito utilizando cualquier método de extracción de ADN estándar. Para el aislamiento rápido de ADN, utilizar un High Pure PCR plantilla de la preparación del kit (Roche Applied Bioscience).
  3. Recombinante progenie son identificados después de genotipado con microsatélites (MS) o polimorfismo de nucleótido único (SNP) en diferentes cromosomas que se pueden diferenciar las dos cepas de los padres de la cruz genética. Un método simplificado con una sola primers marcadas con fluorescencia para MS genotipo de P. yoelii se puede utilizar (ver ref 8,9).

8. Criopreservación de parásitos de la malaria el estadio en sangre

  1. Recoger 0,5-1 ml de sangre infectada por punción cardiaca a partir de un ratón anestesiado con parasitemia de 20.5% en 5-10 ml de suero fisiológico frío.
  2. Centrifugar durante 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante.
  3. Añadir gota a gota, el volumen de 2x 57 Glycerolyte solución (Fenwal Laboratories), en pellets de sangre y se mezcla bien.
  4. Transferir la suspensión a criotubos (0,2-0,5 ml por tubo).
  5. Almacenar la sangre criopreservados a -80 ° C (hasta 1 mes) o en nitrógeno líquido.

9. Los resultados representativos:

En un experimento exitoso, el 5-10% de las líneas de clonado será descendencia recombinante independiente.

Figura 1
Figura 1. Representación esquemática del ciclo de vida y los eventos de recombinación genética en un cruce genético. Eventos de recombinación genética llevará a cabo durante la fase inicial de desarrollo en el mosquito. Después de la fertilización de "haploide" gametos masculinos y femeninos de diferentes bases genéticas en el intestino medio del mosquito, "diploide" cigotos se forman. El cigoto constituye la etapa diploide sólo del ciclo vital del parásito, la meiosis se produce dentro de 12 horas de la fertilización, y todas las fases posteriores en el mosquito y los mamíferos permanecen haploides. Los cigotos resultantes se convierten en ookinetes y ooquistes. El crecimiento y la división mitótica de cada ooquiste produce miles de esporozoitos, que son liberados en hemoceal mosquitos. Los esporozoitos que migran a las glándulas salivales se encuentran en condiciones de ser transmitido a un huésped mamífero, donde el desarrollo del hígado y el rojo las etapas de células sanguíneas se lleva a cabo. Durante el curso de los ciclos de los glóbulos rojos, algunos parásitos pueden diferenciarse en madurar gametocitos masculinos y femeninos. El ciclo vital del parásito se completa cuando estos gametocitos son tomadas por otro mosquito, perpetuando la transmisión.

Figura 2
Figura 2. Herencia de genes nucleares de parásitos de la malaria y la producción de progenie recombinante. Recombinación genética se pueden generar a través de recombinación cromosómica o por eventos de cruce. Progenie homocigótica producida por autofecundación entre gametos de un mismo clon parental 1 o 2 (A y D), respectivamente. B) progenie heterocigota producida por la interacción entre los gametos de los dos clones distintos de los padres, los núcleos recombinante (óvalos azules) está formado por recombinación cromosómica solo. C) descendencia heterocigota produce a partir de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos clones de padres diferentes, los núcleos recombinante (óvalos de color rojo) se forma por cruces entre las cromátidas no hermanas de los cromosomas homólogos.

Figura 3
Figura 3. Morfología del roedor parásito de la malaria Plasmodium yoelii. A) Fase de anillo, B) trofozoíto, C) esquizonte, D) merozoitos, E) gametocitos machos inmaduros, F) gametocitos varón maduro, G) gametocitos hembra inmadura, H) gametocitos hembra madura, I) del intestino medio con ooquistes en el día 10 después de alimentación (ooquistes maduros indicado por las flechas; 200x aumentos), J) las glándulas salivales del mosquito (100x), K) esporozoitos (400x aumentos).

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Discusión

Nos demuestran las técnicas para la producción de un cruce genético de los roedores malaria Plasmodium yoelii, que también es aplicable a la producción de cruces genéticos en malarias roedores. Infecciones de los ratones con un solo clones parentales usualmente se realizan para determinar la transmisión correcta de los parásitos de los padres para asegurarse de que los padres son competentes en la producción de gametos funcionales antes de realizar una cruz.

Transmisión con éxito a ...

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Divulgaciones

Debido a que los autores son empleados del gobierno y esto es un trabajo del gobierno, la obra es de dominio público en los Estados Unidos. Sin perjuicio de cualquier otro acuerdo, el NIH se reserva el derecho de proporcionar trabajo a PubMedCentral para la visualización y el uso por el público, y PubMedCentral puede etiquetar o modificar el trabajo en consonancia con sus prácticas habituales. Usted puede establecer los derechos fuera de los EE.UU. sujeto a una licencia de uso por el gobierno.

Agradecimientos

Agradecemos a los Dres Randy Elkins, Kastenmayer Robin, Ted Torrey, Pare Dan y Lehman Tovi para la lectura crítica de los manuscritos. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud, y por el Programa Nacional de Investigación Básica 973 de China, # 2007CB513103. Damos las gracias al NIAID intramuros editor Brenda Rae Marshall de ayuda.

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Materiales

MATERIAL COMPLEMENTARIO:

  • Mantenimiento de los ratones de laboratorio
  • Mantenimiento de los mosquitos de laboratorio
  • El examen microscópico de frotis finos de sangre teñidas con Giemsa
  • Medida de la densidad de glóbulos rojos

Mantenimiento de los ratones de laboratorio

Las hembras de la cepa endogámica de ratón de laboratorio BALB / c, de 5 a 8 semanas de edad, se utilizan en el estudio. Los ratones se encuentran en un nivel sólido de fondo de la jaula de policarbonato con tapa de alambre-bar, equipado con alimentador y una botella de agua. Los ratones se mantienen a una temperatura constante (25 ± 1 ° C) en 12:12 horas luz: oscuridad ciclo. Los ratones se les permite alimentarse de 2018S Harlan dieta Teklad global del 19% de proteínas de roedores extruido (esterilizable, de Harlan-Teklad) y se suministra con libitum acidificada beber agua ad. Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales y el empleo en el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas en el protocolo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Mantenimiento de los mosquitos de laboratorio

Los mosquitos son de una colonia de laboratorio criados de Anopheles stephensi. Los adultos son mantenidos en jaulas de nylon mantienen en una temperatura y humedad ambiente controlada (23 a 25 ° C para el Plasmodium yoelii y chabaudi Plasmodium, y de 19 a 21 ° C para el Plasmodium berghei, 80 a 95%; en 12:12 horas de luz: oscuridad ciclo). Los mosquitos adultos se alimentan con glucosa al 10% y 2,00% para-aminobenzoico (PABA) solución complementa el agua. Para obtener alta calidad de los adultos, 500 larvas se desarrollan en una condición de baja densidad en 1 litro de agua destilada en un 1.000 cm 3 plato abierto suministrados con aproximadamente 1 mg de bicarbonato de sodio. Después de la eclosión, las larvas se dan TetraMin polvo (PETCO) hasta que se conviertan en la fase de pupa y se transfieren a las jaulas de los mosquitos adultos emergentes.

El examen microscópico de frotis finos de sangre teñidas con Giemsa

Usando tijeras limpias recortar la punta (1,0 mm) de la cola del ratón infectado. Coloque una gota (0,5 a 1,0 l) de sangre en un portaobjetos de la cola muestra limpia. Ratón detener la hemorragia en 1-2 min. Coloque una diapositiva esparcidor limpio en la parte superior de la gota de sangre, el mantenimiento a un ángulo de 45 ° respecto a la diapositiva de muestra, y permitir que la sangre para absorber a la totalidad del ancho de la cruceta. Sostenga el portaobjetos e impulsar la diapositiva esparcidor rápida y fluida para producir una capa delgada. Dejen que la sangre seca, y luego sumerja el portaobjetos en metanol absoluto. Permita que la diapositiva se seque al aire una vez más antes de cubrirla con Giemsa (10% de colorante Giemsa en agua destilada). Después de incubar las películas delgadas de sangre durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, enjuagar cuidadosamente los portaobjetos con agua del grifo y dejar secar al aire. Examine el número de glóbulos rojos infectados (iRBC véase el cuadro 3 para la morfología de los infectados RBC) bajo un microscopio de luz con aceite de inmersión en 1000x (con lente de objetivo 100x) y calcular la parasitemia (el número de iRBC por cada 100 eritrocitos contados). Las diferentes cepas de parásitos de la malaria variar la tasa de crecimiento y patogenicidad. Seguimiento de parasitemias etapa sangre puede llevar a cabo 24 horas después de la inyección, dependiendo de la dosis de los parásitos de la malaria sangre escenario. Por ejemplo, los ratones se microscópicamente positivo de 24 horas cuando se les inyectó 10 7 RBC infectados por vía intraperitoneal o 10 6 RBC infectados por vía intravenosa.

Medida de la densidad de glóbulos rojos

Al igual que los niveles de parasitemias, glóbulos rojos (RBC) de densidad en los ratones infectados varía a lo largo del curso de la infección. Densidad de glóbulos rojos se debe medir al cabo de 1-2 horas antes del inicio de la infección de un solo y mezclado por clonación y los experimentos de clonación. Hay dos métodos para la medición de la densidad de glóbulos rojos: un recuento manual con hemocitómetro Neubauer y un conteo automático usando un Cellometer (Nexcelom Bioscience). En ambos métodos, extraer 1 l de sangre del ratón de cola con un capilar de vidrio (VWR) y diluir en 10 ml de PBS y mezclar bien. Para utilizar un hemocitómetro Neubauer, carga de 20 l de la suspensión en el hemocitómetro. Coloque el hemocitómetro en un microscopio óptico con lente de objetivo de 10x. El hemocitómetro contiene una cuadrícula dividida en 9 cuadrados grandes, y 4 cuadrados grandes en la esquina se dividen en 16 cuadrados pequeños. Cuente el número total de células en cada uno de los 16 pequeños cuadrados en las cuatro esquinas. Para evitar la parcialidad o el recuento de células que se superponen a una línea de cuadrícula, el recuento de una celda como "en" si se solapa las líneas de arriba oa la derecha y "fuera" si se solapa las líneas de abajo o de izquierda. Estimar el número de células por una pequeña plaza y se dividen por 0,00625 (el volumen de una pequeña plaza es de 6,25 nL). Esto produce el número de células por microlitro (ymu, L). De estos datos, calcular el final de la densidad de células rojas de la sangre, multiplicando con 10.000 (un factor de dilución). Enjuague la hoja de la cubierta y la cámara de contar con agua destilada y etanol al 70%, el aire seco. Por otra parte, la carga de 20 l de la suspensión en un portaobjetos Cellometer cámara de recuento. Insertar la diapositiva en una cámara de diapositivas Cellometer (el lector). Inicie el software Cellometer, seleccione la opción "de células rojas de la sangre" y, a introducir un factor de dilución de 10.000. Registro de la densidad de glóbulos rojos.

Referencias

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