Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Resumen

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos de Plasmodium yoelii Y es aplicable a otros parásitos de roedores malaria.

Resumen

Variación en la respuesta a los medicamentos antimaláricos y en la patogenicidad de los parásitos de la malaria es de importancia biológica y médica. Mapas de los vínculos ha llevado a la identificación exitosa de los genes o loci subyacente varios rasgos en los parásitos del paludismo de los roedores y los humanos ^{1-3 4-6.} El parásito de la malaria Plasmodium yoelii es una de las especies de malaria muchos aislado de roedores silvestres de África y ha sido adaptado para crecer en el laboratorio. Esta especie se reproduce muchas de las características biológicas de los parásitos del paludismo humano; marcadores genéticos como los microsatélites y marcadores de fragmentos amplificados polimorfismo en la longitud (AFLP) también se han desarrollado para el parásito de ^7-9. Así, los estudios genéticos de los parásitos del paludismo de roedores se pueden realizar para complementar la investigación sobre el Plasmodium falciparum. En este sentido, demostrar las técnicas para la producción de un cruce genético de P. yoelii que fueron los primeros por primera vez por los Dres. David Walliker, Richard Carter, y sus colegas de la Universidad de Edimburgo ^10.

Cruces genéticos de P. yoelii y otros parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo mediante la infección de ratones Mus musculus con un inóculo que contiene gametocitos de dos clones genéticamente distintas que se diferencian en fenotipos de interés y permitiendo que los mosquitos que se alimentan de los ratones infectados cuatro días después de la infección. La presencia de gametocitos masculinos y femeninos en la sangre del ratón es microscópicamente confirmados antes de alimentar. Dentro de las 48 horas después de comer, en el intestino medio del mosquito, los gametocitos haploides se diferencian en gametos masculinos y femeninos, fertilizar, y forma un cigoto diploide (Fig. 1). Durante el desarrollo de un cigoto en un oocineto, meiosis parece ocurrir ^11. Si el cigoto se deriva a través de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos parásitos genéticamente distintos, los intercambios genéticos (recombinación cromosómica y cross-overs entre las cromátidas no hermanas de un par de cromosomas homólogos;. Fig. 2) puede ocurrir, resultando en la recombinación de material genético en loci homólogos. Cigoto experimenta dos divisiones nucleares sucesivas, dando lugar a cuatro núcleos haploides. Un oocineto más se convierte en un ooquiste. Una vez que el ooquiste madura, miles de esporozoitos (la descendencia de la cruz) se forman y se liberan en hemoceal mosquito. Esporozoitos se cosechan a partir de las glándulas salivales y se inyecta en un nuevo huésped murino, donde el desarrollo de la etapa pre-eritrocítica y eritrocítica se lleva a cabo. Formas eritrocíticas se clonan y se clasifican con respecto a los caracteres distintivos de las líneas parentales antes de mapeo de ligamiento genético. Control de las infecciones de los distintos clones de los padres se llevan a cabo en la misma forma que la producción de un cruce genético.

Protocolo

Técnicas de asepsia deben ser aplicadas a todos los materiales que serán administrados a los animales para evitar la introducción accidental de agentes infecciosos exógenos en los ratones que se pueden confundir los resultados experimentales.

1. La infección de ratones de laboratorio con parásitos de la malaria el estadio en sangre

1. A temperatura ambiente, descongelar dos viales que contienen la sangre congelada parásitos de la malaria etapa que se cruzaron. En este ejemplo, dos cepas de roedores parásito de la malaria utiliza son el Plasmodium yoelii yoelii y nigeriensis Plasmodium yoelii.
2. Adaptarse ....

Discusión

Nos demuestran las técnicas para la producción de un cruce genético de los roedores malaria Plasmodium yoelii, que también es aplicable a la producción de cruces genéticos en malarias roedores. Infecciones de los ratones con un solo clones parentales usualmente se realizan para determinar la transmisión correcta de los parásitos de los padres para asegurarse de que los padres son competentes en la producción de gametos funcionales antes de realizar una cruz.

Transmisión con éxito a .......

Materiales

MATERIAL COMPLEMENTARIO:

• Mantenimiento de los ratones de laboratorio
• Mantenimiento de los mosquitos de laboratorio
• El examen microscópico de frotis finos de sangre teñidas con Giemsa
• Medida de la densidad de glóbulos rojos

Mantenimiento de los ratones de laboratorio

Las hembras de la cepa endogámica de ratón de laboratorio BALB / c, de 5 a 8 semanas de edad, se utilizan en el estudio. Los ratones se encuentran en un nivel sólido de fondo de la jaula de policarbonato con tapa de alambre-bar, equipado con alimentador y una botella de agua. Los ratones se mantienen a una temperatura constante (25 ± 1 ° C) en 12:12 horas luz: oscuridad ciclo. Los ratones se les permite alimentarse de 2018S Harlan dieta Teklad global del 19% de proteínas de roedores extruido (esterilizable, de Harlan-Teklad) y se suministra con libitum acidificada beber agua ad. Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales y el empleo en el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas en el protocolo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Mantenimiento de los mosquitos de laboratorio

Los mosquitos son de una colonia de laboratorio criados de Anopheles stephensi. Los adultos son mantenidos en jaulas de nylon mantienen en una temperatura y humedad ambiente controlada (23 a 25 ° C para el Plasmodium yoelii y chabaudi Plasmodium, y de 19 a 21 ° C para el Plasmodium berghei, 80 a 95%; en 12:12 horas de luz: oscuridad ciclo). Los mosquitos adultos se alimentan con glucosa al 10% y 2,00% para-aminobenzoico (PABA) solución complementa el agua. Para obtener alta calidad de los adultos, 500 larvas se desarrollan en una condición de baja densidad en 1 litro de agua destilada en un 1.000 cm ³ plato abierto suministrados con aproximadamente 1 mg de bicarbonato de sodio. Después de la eclosión, las larvas se dan TetraMin polvo (PETCO) hasta que se conviertan en la fase de pupa y se transfieren a las jaulas de los mosquitos adultos emergentes.

El examen microscópico de frotis finos de sangre teñidas con Giemsa

Usando tijeras limpias recortar la punta (1,0 mm) de la cola del ratón infectado. Coloque una gota (0,5 a 1,0 l) de sangre en un portaobjetos de la cola muestra limpia. Ratón detener la hemorragia en 1-2 min. Coloque una diapositiva esparcidor limpio en la parte superior de la gota de sangre, el mantenimiento a un ángulo de 45 ° respecto a la diapositiva de muestra, y permitir que la sangre para absorber a la totalidad del ancho de la cruceta. Sostenga el portaobjetos e impulsar la diapositiva esparcidor rápida y fluida para producir una capa delgada. Dejen que la sangre seca, y luego sumerja el portaobjetos en metanol absoluto. Permita que la diapositiva se seque al aire una vez más antes de cubrirla con Giemsa (10% de colorante Giemsa en agua destilada). Después de incubar las películas delgadas de sangre durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, enjuagar cuidadosamente los portaobjetos con agua del grifo y dejar secar al aire. Examine el número de glóbulos rojos infectados (iRBC véase el cuadro 3 para la morfología de los infectados RBC) bajo un microscopio de luz con aceite de inmersión en 1000x (con lente de objetivo 100x) y calcular la parasitemia (el número de iRBC por cada 100 eritrocitos contados). Las diferentes cepas de parásitos de la malaria variar la tasa de crecimiento y patogenicidad. Seguimiento de parasitemias etapa sangre puede llevar a cabo 24 horas después de la inyección, dependiendo de la dosis de los parásitos de la malaria sangre escenario. Por ejemplo, los ratones se microscópicamente positivo de 24 horas cuando se les inyectó 10 ⁷ RBC infectados por vía intraperitoneal o 10 ⁶ RBC infectados por vía intravenosa.

Medida de la densidad de glóbulos rojos

Al igual que los niveles de parasitemias, glóbulos rojos (RBC) de densidad en los ratones infectados varía a lo largo del curso de la infección. Densidad de glóbulos rojos se debe medir al cabo de 1-2 horas antes del inicio de la infección de un solo y mezclado por clonación y los experimentos de clonación. Hay dos métodos para la medición de la densidad de glóbulos rojos: un recuento manual con hemocitómetro Neubauer y un conteo automático usando un Cellometer (Nexcelom Bioscience). En ambos métodos, extraer 1 l de sangre del ratón de cola con un capilar de vidrio (VWR) y diluir en 10 ml de PBS y mezclar bien. Para utilizar un hemocitómetro Neubauer, carga de 20 l de la suspensión en el hemocitómetro. Coloque el hemocitómetro en un microscopio óptico con lente de objetivo de 10x. El hemocitómetro contiene una cuadrícula dividida en 9 cuadrados grandes, y 4 cuadrados grandes en la esquina se dividen en 16 cuadrados pequeños. Cuente el número total de células en cada uno de los 16 pequeños cuadrados en las cuatro esquinas. Para evitar la parcialidad o el recuento de células que se superponen a una línea de cuadrícula, el recuento de una celda como "en" si se solapa las líneas de arriba oa la derecha y "fuera" si se solapa las líneas de abajo o de izquierda. Estimar el número de células por una pequeña plaza y se dividen por 0,00625 (el volumen de una pequeña plaza es de 6,25 nL). Esto produce el número de células por microlitro (ymu, L). De estos datos, calcular el final de la densidad de células rojas de la sangre, multiplicando con 10.000 (un factor de dilución). Enjuague la hoja de la cubierta y la cámara de contar con agua destilada y etanol al 70%, el aire seco. Por otra parte, la carga de 20 l de la suspensión en un portaobjetos Cellometer cámara de recuento. Insertar la diapositiva en una cámara de diapositivas Cellometer (el lector). Inicie el software Cellometer, seleccione la opción "de células rojas de la sangre" y, a introducir un factor de dilución de 10.000. Registro de la densidad de glóbulos rojos.