Se presenta el desarrollo de un sistema de selección negativa en E. histolytica Basado en la expresión transgénica de una proteína quimérica (FCU1) y la selección con el profármaco 5-fluorocitosina. La proteína FCU1 es una fusión de la levadura deaminasa citosina y uracilo fosforribosiltransferasa. Expresión de FCU1 traducido en un aumento E. histolytica Sensibilidad hacia la 5-fluorocitosina.
Artículo de método
Desarrollo de un marcador negativo seleccionable para Entamoeba histolytica
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Resumen
Resumen
Entamoeba histolytica es el agente causal de la amibiasis e infecta hasta un 10% de la población mundial. Las técnicas moleculares que han permitido a la arriba y abajo-regulación de la expresión génica se basan en la transfección de plásmidos mantenido de forma estable. Si bien estos han aumentado nuestra comprensión de los factores de virulencia de Entamoeba, la capacidad de integrar ADN exógeno en el genoma, lo que permitiría revertir experimentos genéticos, sería una ventaja significativa en el estudio de este parásito. Los desafíos presentados por este organismo incluyen la incapacidad para seleccionar a los eventos de recombinación homóloga y la dificultad para curar ADN plásmido episomal de trofozoítos transfectadas. Los resultados más adelante en un contexto de alta de ADN exógeno, un problema importante en la identificación de trofozoitos en el que una bona fide caso de la integración genómica se ha producido. Se presenta el desarrollo de un sistema de selección negativa basada en la expresión transgénica de una citosina deaminasa levadura y uracilo fosforribosil transferasa quimera (FCU1) y la selección con el profármaco 5-fluorocitosina (5-FC). La enzima convierte FCU1 no tóxico 5-FC en tóxico 5-fluorouracilo y 5-fluorouridina-5'-monofosfato de E.. líneas histolytica expresar FCU1 resultaron ser 30 veces más sensibles a los profármaco comparación con la cepa control.
Protocolo
1. FCU sistema de selección negativa en Entamoeba histolytica
- La línea de control de vectores (HM1 / pKT3M) y la línea experimental (HM1/pKT3M-FCU1) fueron generados por 1,2 se ha descrito anteriormente técnicas. Semillas de las líneas de estudio de los tubos de valores en T-25 frascos y mantener la selección mediante la adición de antibiótico apropiado (12 mg / ml de G418) en TYI-S-33 3 medianas. Los frascos deben ser del 70-80% confluente después de 16-18 horas de crecimiento a 37 ° C.
- Prepare una solución fresca de valores de 50 mm de 5-fluorocitosina (5-FC, Sigma) en agua tibia TYI-S-33. Vortex rigurosamente durante varios minutos para disolver 5-FC por completo. Filtro a esterilizar la solución stock de pasar por un filtro de 0,22 micras.
- Trofozoítos de la cosecha mediante la colocación de las botellas en hielo durante 3-5 minutos y la recolección de las células por centrifugación a 200xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado en medio fresco TYI y el recuento de las células.
- Diseño de un experimento típico utiliza 0,5 x 10 4 células por pocillo de una placa de 48 y en un volumen final de 1 ml, y se repite por triplicado para cada condición de prueba. Además, para facilitar las mediciones de fluorescencia, un plato aparte se utiliza para cada cepa por cada punto del tiempo.
- Semillas de 0,5 x 10 4 células por pocillo para cada prueba 5-FC concentración, por triplicado. Mantener la presión de selección de antibióticos en el medio TYI. Ahora agregue la cantidad necesaria de 5-FC solución madre y trofozoítos a cada pocillo.
- Las placas se incuban en una bolsa anaeróbica a 37 º C.
2. Determinación de la eficiencia de la selección
- Prepare 2 mg / ml de solución de archivo de la célula de seguimiento verde CMFDA (Invitrogen) en DMSO. Para hacer la solución de trabajo diluir la acción de 1000 veces en medio libre de suero TYI.
- Se elimina el medio totalmente de placas de cultivo de trofozoíto y reemplazar con 150 l de suero libre de CMFDA TYI contiene. Continuar la incubación a 37 ° C durante 1 hora.
- Retire la solución de colorante de los pozos y leer la placa en la espectrofluorómetro Spectramax M2 microplacas. La longitud de onda de excitación se debe establecer a 492 nm y la emisión de fluorescencia leer a 517 nm.
- Comparar los valores de fluorescencia para el control de las células frente a los transfectantes de prueba.
- Seguir leyendo las placas en cada intervalo de tiempo. Uso positivo adecuado (TYI solamente) y negativos (25 mg / ml de higromicina) pozos de control en cada plato.
3. Resultados representante
La E. transfectantes histolytica mostró sólida expresión de codón optimizado FCU1 recombinante (Figura 1). Cuando este protocolo se sigue correctamente el resultado es la eliminación selectiva de E. histolytica células que expresan FCU1 en presencia de 0,5 mM 5-fluorocitosina. Control de las células, por el contrario seguirá creciendo normalmente en concentraciones de hasta 5 mm de 5-FC y llegar a la confluencia entre el 72 y 96 horas (Figura 2-a). El FCU1 células portadoras a las 48 horas está completamente lisadas en los pozos de tratamiento se observan bajo el microscopio. Estos también muestran una disminución de la fluorescencia cuando se tiñen con los colorantes vitales CMFDA, que se utiliza en los estudios cuantitativos participación de gran número de muestras (figura 2-b). El sistema FCU1/5-FC es una herramienta de selección negativa eficaz y potente para E. histolytica trofozoítos.
Figura 1. Generación de E. histolytica HM1 transfectantes que expresan marcador de selección negativa
(A) proteínas recombinantes FCU1 se detectó en un Western blot utilizando anticuerpos anti-c-Myc (panel superior). Como era de esperar, una banda de 42kDa podrían ser detectados (que se muestra con una flecha) en el lisado total de los transfectantes FCU, pero no en el vector solo transfectantes control. La imagen inferior muestra la misma mancha probaron con anticuerpos contra la actina como control de carga. (B) Los resultados de la PCR cuantitativa en tiempo real que muestra la expresión de ARNm específicos FCU1 normalizado a lgl4 control.
Figura 2. Fármacos in vitro la sensibilidad de E. histolytica transfectantes que expresan marcador de selección negativa
Las curvas de supervivencia de los transfectantes control (a) y (b) transfectantes FCU1 expresar cultivadas en 48 y placa. Las células fueron cultivadas en presencia de concentraciones crecientes del profármaco-5-fluorocitosina, la supervivencia celular se cuantificó por tinción CMFDA en cada intervalo de tiempo indicado en el eje X. El eje Y representa unidades de fluorescencia y es un reflejo directo de la población de células sobrevivientes. Tenga en cuenta que la FCU1 transfectantes que expresan mostró una sensibilidad significativa en la concentración de 0,5 mM profármaco en comparación con el control. No se observaron células en el punto 120 horas de tiempo en estos pozos como comcomparación con el crecimiento confluente visto en los pozos de control correspondiente al microscopio (datos no mostrados). Hygro denota 25μg / ml de higromicina utilizó como control negativo.
Discusión
Aunque ha habido avances sustanciales en la Entamoeba biológica herramientas moleculares que no hay métodos actualmente disponibles para eliminar o alterar los genes 4. Derribo de la expresión de genes específicos se ha logrado mediante el uso de 5 ARN horquilla, pequeños ARN de interferencia bacteriana 6 y expresó dsRNA 7. Sin embargo, estos métodos si bien son eficaces para el objetivo genes respectivos, tienen varias limitaciones, incluyendo el uso de productos químicos costosos, la selección continua de los antibióticos y la necesidad de validación constante debido a la alta incidencia de reversión que ocurre en el tiempo (Alicia Linford, comunicación personal) 8.
Cualquier plásmido puede replicarse en Entamoeba, ya que aparentemente no es un requisito secuencia estricta de los orígenes de replicación del ADN 9, y así una vez transfectadas, por lo general es difícil de curar un plásmido. Esto limita el posible uso de plásmidos intactos en los experimentos de recombinación de genes y por nocaut. Marcadores negativos de selección son componentes clave de los métodos de manipulación genética, ya que se puede utilizar para eliminar subpoblaciones recombinante. Hemos expresado con éxito un codón optimizado FCU1 gen en Entamoeba histolytica y probado su potencial como marcador de selección negativa. Esta fusión de genes ha sido utilizada para la terapia génica suicida de células tumorales humanas y metaboliza el profármaco 5-FC en productos derivados tóxicos, provocando la inhibición de la síntesis de ARN y ADN 10. FCU1 recientemente ha sido utilizada como un marcador negativo seleccionable en Plasmodium, otro parásito protozoario. Plasmodium berghei las células que expresan FCU1 se encontraron casi 1000 veces más sensible que el profármaco in vitro e in vivo del tratamiento con 5-FC mató a más de 99,9% de los infectando los parásitos recombinantes en el modelo de ratón eritrocítica etapas de la malaria 11. E. Las células que expresan histolytica FCU1 sólo mostró una sensibilidad 30 veces mayor que el profármaco 5-FC, en contraste con la sensibilidad observada en P. berghei. Las posibles razones para esto podría ser una gran piscina de nucleótidos disponibles en el medio de cultivo en competencia con los metabolitos tóxicos.
En tanto P. berghei y P. falciparum en el marcador FCU1 se ha utilizado en la interrupción de genes específicos. estudios 11,12. Nuestro objetivo es manipular el genoma de la Entamoeba usando recombinación homóloga. La validación del sistema de selección negativa FCU1/5-FC es un paso importante hacia este objetivo.
Divulgaciones
La producción de este video fue patrocinado por Sigma Aldrich, Inc., que produce algunos de los reactivos utilizados en este artículo.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Philippe Erbs para que nos proporciona la secuencia de los genes FCU1. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención AI 26649.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medio TYI-S-33 | ATCC | Referencia incluida en el texto | |
| 5-Fluorocitosina | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Rastreador celular verde CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Lector de placas Spectra Max M2 | Molecular Devices |
Referencias
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