Registros electrofisiológicos de la ruta de fibra gigante de D. melanogaster</em

Resumen

El sistema de fibra gigante es un circuito simple neuronal de los adultos Drosophila melanogaster Que contiene la mayor neuronas de la mosca. Se describe el protocolo para la supervisión de la transmisión sináptica a través de esta vía mediante el registro de los potenciales postsinápticos en el dorsal longitudinal (DLM) y los músculos tergotrochanteral (TTM) después de la estimulación directa de las interneuronas de fibra gigante.

Resumen

Cuando se asustan adultos de D. melanogaster reaccionar saltando en el aire y volando. En muchas especies de invertebrados, entre ellos D. melanogaster, el "escape" (o "susto") la respuesta en la etapa adulta es mediado por el circuito neuronal multi-componente llamado el sistema de fibra gigante (GFS). El tamaño relativo grande de las neuronas, su morfología distintiva y una conectividad sencilla que el GFS un sistema atractivo modelo para el estudio de circuitos neuronales. La vía de las EFP se compone de dos simetría bilateral gigante de fibra (FC) interneuronas cuyos axones descienden del cerebro a lo largo de la línea media en el ganglio torácico a través de la conectivo del cuello uterino. En el neuromere mesothoracic (T2) de los ganglios ventrales la forma FC electro-químicas sinapsis con 1) la dendrita gran medial de la motorneuron ipsilateral (TTMn) que impulsa el músculo tergotrochanteral (TTM), el principal extensor de fémur mesothoracic / pierna , y 2) la contralateral interneurona periférica sinapsis (PSI), que a su vez en forma química (colinérgico) sinapsis con las motoneuronas (DLMns) de los músculos dorsales longitudinales (DLMS), los depresores del ala. La vía neuronal (s) a los músculos dorsovental (DVMS), los ascensores del ala, todavía no se ha resuelto (la DLMS y veterinarios son conocidos conjuntamente como los músculos de vuelo indirecto - que no están vinculados directamente a las alas, sino que se mueven los alas indirectamente al distorsionar la cutícula dorsal cercana) (King y Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). La activación de di-sináptica de la DLMS (a través de PSI) provoca un pequeño retraso, pero importante, en el momento de la contracción de estos músculos en relación con la activación monosináptico de TTM (~ 0,5 ms), que permite la TTMs extender primero el fémur y en impulsar la volar fuera de la tierra. El TTMs al mismo tiempo se extienden a activar el DLMS que a su vez entre sí se extienden a activar el vóltmetros digitales para la duración del vuelo. La vía de GF puede ser activado ya sea indirectamente mediante la aplicación de una experiencia sensorial (por ejemplo, "soplo de aire" o "luces-off") de estímulo, o directamente por un estímulo supra-umbral eléctrica en el cerebro (que se describe aquí). En ambos casos, un potencial de acción llega a la TTMs DLMS y exclusivamente a través de la FC, PSI, y motoneuronas TTM / DLM, aunque el TTMns y DLMns tienen otros, aún no identificado, los estímulos sensoriales. Medir "la respuesta de latencia" (el tiempo entre el estímulo y la despolarización del músculo) y el "después de la estimulación de alta frecuencia" (el número de respuestas exitosas a un cierto número de estímulos de alta frecuencia) proporciona una forma de evaluar de forma reproducible y cuantitativamente el estado funcional de los componentes EFP, incluyendo tanto las sinapsis central (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) y la química (glutamatérgicas) las uniones neuromusculares (TTMn-TTM y DLMn DLM-). Se ha utilizado para identificar los genes implicados en la formación de sinapsis central y para evaluar la función del SNC.

Protocolo

1. Equipos y Materiales

1. Estos experimentos utilizar una configuración estándar de electrofisiología compone de un estimulador, una unidad de aislamiento de estímulos, dos amplificadores de microelectrodos, un sistema de adquisición de datos y un ordenador con el software de colección. El equipamiento adicional incluye una jaula de Faraday, un microscopio estereoscópico con un codo, una mesa de aislamiento de vibración, una fuente de luz, y una plataforma de grabación.
2. Cinco micromanipuladores se utilizan. Dos micromanipuladores requieren controles muy bien para el posicionamiento de los electrodos de registro, mientras que los otros tres micromanipuladores sólo requieren controles a la posición bruta de los dos electrodos de estimulación y el electrodo de masa. El micromanipulador para el electrodo de registro DLM se coloca en el extremo final de la preparación (a la izquierda del experimentador) y el micromanipulador para el electrodo de registro TTM se coloca entre el experimentador y el lado de la preparación (un poco a la izquierda del experimentador). Los dos micromanipuladores que llevará a cabo la simulación de electrodos se colocan a la cabeza de la preparación (a la derecha del experimentador). El micromanipulador para el electrodo de masa se coloca en el extremo de la preparación
3. Tire de microelectrodos de vidrio de grabación con resistencias de 40 a 60 mW y almacenar planos en un plato con el apoyo de la cera. Para la estimulación, dos electrolíticamente (NaOH) afilado de electrodos de tungsteno se utilizan. Un alambre de tungsteno, o un tercer electrodo fabricado electrolíticamente se usa como base. Los electrodos de estimulación y el suelo está preparado y unido a la micromanipuladores antes del inicio de la sesión experimental y no necesitan ser sustituidos por la duración de la sesión.

2. Preparación de la D. melanogaster

1. Una vez que su equipo está configurado, es el momento de preparar las moscas. Anestesiar a las moscas por el enfriamiento de hielo sobre ellos o mediante el uso de CO _2. Si el CO ₂ es utilizado, entonces el tiempo suficiente (unos 20 minutos) para los efectos del gas a desaparecer antes de comenzar el experimento.
2. El uso de fórceps para la transferencia de las moscas suavemente por sus piernas a un plato que contiene una plataforma de cera pendiente suave en un ángulo de aproximadamente 45 °. Los siguientes cuatro pasos se realizan bajo un microscopio de disección lejos (pero cerca de) el equipo de grabación.
3. El siguiente paso es asegurar la marcha de cera. Oriente el lado ventral volar hacia abajo, hacia arriba con su anterior frente a la pendiente. Con un par de pinzas finas, se extienden hacia afuera las piernas, en parejas, y empujarlos en la cera.
4. Familiarícese con la ubicación de los músculos que se registró a partir de: el músculo longitudinal dorsal, o DLM, y el músculo tergotrochanteral o TTM. Los sitios de fijación subcuticular de la DLMS se corresponden con la zona comprendida entre la línea media dorsal y la parte dorsal anterior cerdas (o setas). Los sitios de unión de TTM se encuentran el dorso de la parte posterior y anterior supra-alar cerdas. Asegurarse de que las alas no se obstruya el acceso a las fibras de DLM o TTM, mantener las alas hacia el exterior y "pegar" a la cera.
5. El uso de un buen par de pinzas, tire de la trompa hacia afuera con cuidado, y seguro que mediante la inmersión en la cera. Este es un paso crítico que requiere una cierta práctica, ya que la trompa es suave y se desprende fácilmente del resto de la cabeza. Si eso ocurre, deseche la marcha y empezar de nuevo. La falta de seguro de la cabeza de esta manera da lugar a problemas al insertar los electrodos de estimulación a través de los ojos.

3. La colocación de los electrodos

1. Una vez que la mosca está anclada a la cera, la transferencia de la fuente con la marcha unida bajo el microscopio estereoscópico que se encuentra dentro de la jaula de Faraday. Orientar la marcha hacia un lado con la cabeza de la mosca a la derecha del experimentador.
2. El siguiente paso es insertar los electrodos. Electrodos de tierra y estimulante puede ser insertado sin mirar por el microscopio. Buenas grabaciones se basan en el empalamiento precisa, por lo que es una buena idea a la práctica el manejo del micromanipulador. Lleve los electrodos cerca de los sitios de inserción con la ayuda de micromanipulador para facilitar su adecuada colocación y grabaciones posteriores.
3. Baje el electrodo de tierra en el extremo posterior del abdomen mediante las ruedas de ajuste en el micromanipulador. Para colocar los electrodos de tungsteno afilada estimulante en el cerebro, el uso del micromanipulador a la posición de la punta de uno de los electrodos por lo que sólo toca uno de los ojos de mosca. Haga lo mismo con el otro para los dos electrodos son sólo tocar la parte exterior de cada ojo. A continuación, pulse los electrodos, a su vez, a través de cada ojo para que las puntas de los electrodos de llegar al cerebro situada en la parte posterior de la cápsula de la cabeza (alrededor de 2 a 3 mm).
4. Electrodos colocados correctamente se activará el sistema de fibra gigante. Para probar que los electrodos de estimulación se colocan correctamente, aplique un poco (0,03 ms) Estímulo de 30 a 60 V a través de los electrodos de estimulación, y buscar el movimiento de las alas y espasmos de los músculos de vuelo / la pierna "
5. El siguiente paso es hacer una copia de llenar los microelectrodos de vidrio con KCl 3M con un Hamilton o el calor-sacó una jeringa de plástico, y los situará en el micromanipulador de control fino. Microelectrodos insertado correctamente puede ser utilizado para varias series de experimentos.
6. La primera grabación de electrodos se inserta en una fibra de DLM. Hay dos DLMS bilateralmente simétricas, cada una se compone de seis fibras musculares individuales. Las grabaciones se puede hacer desde cualquiera de los seis fibras, sin embargo, las más utilizadas son las fibras de DLM 45 bis y debido a su buena accesibilidad a través de la cara dorsal de la cutícula dorsal 45 B, y el hecho de que tanto las fibras están inervadas por el mismo motorneuron .
7. Utilizando el micromanipulador en el lado más alejado de usted, insertar un electrodo de registro en fibra de DLM 45 bis o b. La pendiente de la plataforma permite que el electrodo DLM para entrar en la cutícula dorsal en un ángulo de ~ 60 a 90, que ayuda a la penetración. Utilizar el software en modo osciloscopio y mirar el monitor de la computadora mientras que la inserción de electrodos de registro en el tórax. Cuando el electrodo ha entrado en un músculo de la línea de base se reducirá a cerca de cero o un valor negativo. Prueba con un único estímulo para ver si se puede observar la respuesta muscular.
8. Inserte el electrodo de grabación en la TTM más cercana a usted. Este electrodo se introduce lateralmente, en frente de usted, debido a la ubicación del sitio de unión del músculo. Una vez más observe el monitor mientras se hace esto y se prueba con un único estímulo una vez que la traza indica el electrodo se encuentra en el músculo.

4. Estimulación y registro

1. Ahora está listo para comenzar a estimular el cerebro y registrar las respuestas de la pierna y los músculos de vuelo. Aplicar un corto (0,03 m) de estímulo a través de los electrodos de estimulación a partir de 30 V y el aumento de 60 V hasta que se observe una respuesta (es decir, una contracción muscular, y una despolarización de las células musculares como se observa en el monitor de la computadora). Para el resto del experimento, establecer el voltaje de 5.10 V por encima del umbral de respuesta.
2. Para medir la latencia de respuesta, con un mínimo de 5 estímulos individuales con un período de descanso de 5 segundos entre cada estímulo.
3. Determinar la "frecuencia de la siguiente" mediante trenes de estímulos a diferentes velocidades. Suele ser de 10 trenes de 10 estímulos se dan a 100 Hz (10 ms entre cada estímulo), 200Hz (5 ms entre cada estímulo) y 300Hz (3 ms entre cada estímulo). Permitir un período de descanso de 2 segundos entre cada tren de estímulos.

5. Resultados: las latencias de respuesta de frecuencia y de continuación en el Camino de fibra gigante

1. La latencia de respuesta es el tiempo entre la estimulación del cerebro y la despolarización del músculo. Esta cifra se compara las latencias de respuesta de DLM y TTM a un único estímulo. Latencias entre 0.7 y 1.2 ms para la vía de GF-TTM y entre el 1,3 y 1,7 ms para la vía de GF-DLM indican una preparación saludable y de la técnica de grabación adecuado. Las latencias puede variar con el genotipo, los antecedentes genéticos, la temperatura y la edad.
   
   Figura 1 (A y B). Representante huellas que muestran las respuestas registradas en el TTMs DLMS y después de un estímulo único a nivel del cerebro.
2. Como se muestra aquí, las grabaciones de la TTM muestran una mayor variabilidad en términos de amplitud y la forma del potencial postsináptico (PSP) en comparación con los de las fibras de DLM grandes, lo que la mayor variabilidad se debe al pequeño tamaño de las fibras musculares TTM. Esta variabilidad, sin embargo, no afecta a los valores de latencia de respuesta para el gigante de fibra-a-TTM vía.
   
   Figura 1 (C y D). Más información "latencia de respuesta" huellas de cuatro moscas individuales, tanto para el TTM y DLM. Tenga en cuenta la variabilidad TTM presentan huellas en forma de PSP, pero la latencia de respuesta se ve afectada. Para DLM hay menos variabilidad en la forma de PSP.
   
   
   
   
3. Comparar la "frecuencia de las siguientes" a 100 Hz, 200 Hz y 300 Hz mediante el cálculo de la proporción de respuestas exitosas (de 10), tanto para DLM y las vías de TTM en cada frecuencia de estimulación. A 100 Hz, tanto TTM y DLM seguir las 01:01 estímulos. En las frecuencias de estimulación por encima de 100 Hz, las respuestas DLM comienzan a mostrar fallas porque la sinapsis química intermediario entre dos interneuronas no tiene suficiente tiempo para recuperarse entre los estímulos. Las respuestas de TTM, sin embargo, siguen siendo de 1:1 con estímulos incluso más allá de 300Hz.
   
   Figura 2. Huellas Representante mostrar la "frecuencia de seguir" las grabaciones. A 100 Hz, tanto TTMs DLMS y responder a los 10 estímulos (izquierda). A 200Hz, las respuestas DLM empiezan a fallar (asterisco).
   
   
   
   

6. Resultados representante

De tipo salvaje de corta latencia respuestas (electrodos estimulados se colocan en los ojos, por encima de los receptores sensoriales y la activación del circuito de GF directamente) depende del genotipo, los antecedentes genéticos, la temperatura y la edad, y oscilan entre 0,7 y 1,2 ms para la vía de GF-TTM y 1,3 ms and1.7 de la vía GF-DLM (Tanouye y Wyman, 1980; Thomas y Wyman, 1984; Engel y Wu, 1992; Allen y Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, inédito). . Esta latencia TTM muy corto se debe a la fuerte sinapsis GF-TTMn electroquímica de la vía monosináptico y la latencia ya DLM se produce debido a la naturaleza disynaptic de la vía, así como la presencia de una sinapsis química (PSI-DLMn). Intermedia y larga latencia respuestas (> 3 m) el resultado de la activación de los aferentes GF y se consiguen ya sea mediante la estimulación de baja intensidad o la prestación de un control visual ("light-off") de la señal. A 100 Hz, tanto TTM y DLM debe seguir las 01:01 estímulos. Por encima de 100Hz respuestas DLM comenzará a mostrar fallos en la sinapsis química entre el PSI y el DLMns no tiene suficiente tiempo para recuperarse entre los estímulos a menos de 10 milisegundos de diferencia. TTM respuestas, sin embargo, seguirá siendo de 1:1 con estímulos incluso más allá de 300Hz (Tanouye y Wyman, 1980; Engel y Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martínez et al, 2007). Las mutaciones en el gen shakB, que codifica una Drosophila brecha cruce del canal ("innexin"), aumenta significativamente la latencia de respuesta de la vía de GF-TTM (alrededor de 1,5 ms), mientras que la rama de GF-DLM no responde (Allen y Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). La respuesta mutante puede ser restaurada mediante la estimulación de los ganglios torácicos directamente, lo que demuestra que el efecto de retraso no se debe a la transmisión neuromuscular alterado. La capacidad de seguir la estimulación de alta frecuencia se ve afectada también en estos mutantes en comparación con las moscas de tipo salvaje, donde las vías de GF-DLM y GF TTM-suelen ser capaces de seguir 10 estímulos con una relación 1:1 hasta 100 Hz y 300 Hz, respectivamente. Es importante señalar que estas frecuencias están muy por encima de las frecuencias de estimulación normal recibidas por la contracción muscular durante el vuelo sostenido (3-10 Hz) (Hummon y Costello, 1989).

Otro parámetro utilizado para describir el comportamiento de las salidas del GFS es el "período refractario", o el mínimo de tiempo entre los pulsos de estímulo gemelas que todavía produce dos respuestas de los músculos. El período refractario varía entre 1.4 ms para TTMs y 15.7 ms para DLMS. El período refractario relativamente largo para DLMS se debe a la relativamente lábil sinapsis químicas en el cruce de PSI-DLMn (Tanouye y Wyman, 1980; Gorczyca y Hall, 1984; Engel y Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen y Godenschwege, 2010).

Discusión

Una de las cosas más importantes que hay que prestar atención a la hora de obtener grabaciones de alta calidad es la orientación adecuada y la salud de la preparación. Idealmente, la mosca debe seguir con vida al final de la sesión de grabación y responder a estímulos eléctricos. Para los electrodos de registro de manera más eficiente penetrar en el exoesqueleto torácico, la mosca se debe pegar a la superficie de tal manera que forman un ángulo recto con los electrodos, si es necesario, la inserción de los electrodos puede ser facilitado mediante la eliminación de una parte de la cutícula dorsal torácica con un bisturí de tungsteno lo que expone el músculo de vuelo DLM (este paso ofrece una ventaja adicional de hacer más difícil para las puntas de los electrodos de vidrio se rompa). Además, el debe tener cuidado para evitar pulsar los electrodos a través de la DLMS subcuticular encuentra y TTMs. La cabeza de la mosca debe estar bien asegurado para permitir la electrodos de estimulación que se ha insertado correctamente en el cerebro y para evitar que se salga durante la sesión de grabación.

Debido a su tamaño y morfología, así descrita, la EFP representa una de las vías neuronales más accesible en la Drosophila. La permeabilidad de las sinapsis eléctricas a los pequeños tintes de peso molecular marcador permite la visualización de neuronas acopladas eléctricamente, y varias líneas GAL4 disponibles permiten manipular los niveles de expresión génica en un subgrupo de células o grupos de células (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) Además de las ventajas antes mencionadas, los dos componentes aferentes y torácica de las propiedades del circuito de pantalla, como la habituación, la recuperación espontánea y deshabituación, haciendo que el GFS Drosophila un modelo de sistema conveniente para el estudio de la plasticidad neuronal (Engel y Wu, , 1996).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NOMBRE	EMPRESA	CAT. #	COMENTARIOS
S48 Plaza de estimulador de impulsos	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
Estimulación unidad	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
SIU5 RF unidad de aislamiento del transformador	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
5A de dos canales del amplificador de microelectrodos intracelulares	Obtención de Instrumentos		http://www.gettinginstruments.com/
Digidata 1440A sistema de adquisición de datos	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Analógico-digital Digidata 1320 y el software Axoscope 9.0	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Grabación manual de plataforma con micromanipulador	Narishige, Sutter Ins., Ins World Precision.		http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/
Fuente de luz	Fostec		http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm
Salvaje M5 estereomicroscopio	Salvaje Heerbrugg		http://www.wild-heerbrugg.com/
Vibraciones mesa aislamiento	TMC		http://www.techmfg.com/
Tubos de borosilicato de microelectrodos	Sutter Instrumento		http://www.sutter.com/index.html
P-95 Micropipeta extractor	Sutter Instrumento		http://www.sutter.com/index.html
Microfil 34 calibre 67 mm (de relleno del electrodo)	Mundial de Instrumentos de Precisión	MF34G-5	http://www.wpi-europe.com/en/
Herramientas de microdisección (pinzas, ...)	Herramientas de Bellas Ciencia		www.finescience.com
Disección (estéreo) microscopio	Leica		http://www.leica-microsystems.com/
Jaula de Faraday	Fabricante desconocido

Otros: jeringas de plástico, cable de tierra de tungsteno y NaOH afilado de electrodos de tungsteno, KCl, la plataforma de cera, una PC con monitor ...