Hiperinsulinémico euglucémico pinza en la rata consciente

Resumen

El clamp hiperinsulinémico euglucémico es el "patrón oro" para la evaluación de la acción de la insulina. La insulina es infundida a una velocidad constante estimular la absorción de la glucosa. La cantidad de glucosa infundida exógenos para contrarrestar esta caída es indicativo de sensibilidad a la insulina. Aquí, el procedimiento se realiza en una rata consciente, sin restricciones.

Resumen

La diabetes tipo 2 (DT2) es el rápido aumento de la prevalencia. Caracterizados por una producción inadecuada de insulina o la incapacidad para utilizar la insulina que produce, los resultados de diabetes tipo 2 en los niveles elevados de glucosa en la sangre. El "patrón oro" en la evaluación de sensibilidad a la insulina es un clamp hiperinsulinémico euglucémico o abrazadera de la insulina. En este procedimiento, la insulina es infundida a una velocidad constante que resulta en una disminución de glucosa en la sangre. Para mantener la glucosa sanguínea a un nivel constante de glucosa exógena (D50) se infunde en la circulación venosa. La cantidad de glucosa infundida para mantener la homeostasis es un indicador de sensibilidad a la insulina. Aquí, se muestra el procedimiento de clamp de básica en el sondaje crónica, rata sin restricciones, consciente. Este modelo permite que la sangre se capturen con un mínimo estrés para el animal. Después de la inducción de la anestesia, una incisión se hace y la arteria carótida común izquierda y la vena yugular derecha se cateteriza. Catéteres insertados se lavan con solución salina heparinizada, a continuación, exteriorizada y seguro. Animales pueden recuperarse durante 4-5 días antes de los experimentos, con el aumento de peso un seguimiento diario. Sólo aquellos animales que recuperar el peso a los niveles pre-operatorios son utilizados para experimentos. En el día del experimento, las ratas en ayuno y conectado a las bombas que contienen insulina y D50. Glucemia basal se evaluó a partir de la línea arterial y se utiliza un punto de referencia durante todo el experimento (euglucemia). Después de esto, la insulina es infundida a una velocidad constante en la circulación venosa. Para que coincida con la caída de la glucosa en la sangre, se infunde D50. Si la tasa de infusión de D50 es mayor que la tasa de captación, un aumento de la glucosa va a producir. Del mismo modo, si la tasa es insuficiente para que coincida con la captación de glucosa en el cuerpo, la caída va a producir. La titulación de glucosa continúa hasta que se estabilicen las lecturas de glucosa se obtienen. Los niveles de glucosa y las tasas de infusión de glucosa estables durante este período son registrados y comunicados. Los resultados proporcionan un índice de sensibilidad de la insulina del cuerpo entero. La técnica puede ser refinado para satisfacer los requisitos específicos experimental. Que se ve reforzada por el uso de trazadores radioactivos que pueden determinar los tejidos a la insulina estimula la captación de glucosa específicos, así como el volumen de negocios de todo el cuerpo la glucosa.

Protocolo

R: El cateterismo quirúrgico de la circulación arterial y venosa

Parte 1: Preparación arteriales y venosos del catéter

1. Cortar 15 cm de PE-50 (diámetro interior de 0,58 mm (0.023 ") x un diámetro exterior de 0.965 mm (0.038"). Corte una sección de 1 mm de tubo de silastic (0,76 mm (0,030 ") de diámetro interno x 1.65mm (0.065 ") de diámetro externo) para su uso como restricción de cuentas. La restricción de cuentas impide la rata que se saquen el catéter una vez que esté en su lugar.
2. Inserte las puntas de las micro pinza de disección en la luz de la perla de restricción y con cuidado coloque la punta de las pinzas de separación para estirar la abertura más amplia. El uso de otro par de micro pinza de disección, deslice el tubo de silastic en la luz de la restricción de cuentas. Asegurar con pegamento adhesivo fuerte (Loctite Super Glue). El talón debe estar plana alrededor del catéter. Permitir que se seque catéter (24).
3. Para una rata de 300 gramos, la línea de la arteria es de ~ 2,7 cm desde el talón de restricción, mientras que la línea es de ~ 3,2 cm yugular. Longitudes de catéter de la restricción se ajustan por 0,5 cm por cada aumento de 100 g en el peso corporal. No bisel de los bordes de la sonda, ya que la punción puede el buque durante la inserción.
4. Inmediatamente antes de la cirugía, llenar las líneas con solución salina heparinizada (10U/ml), sellar ambos extremos con un tapón de tubería de acero inoxidable y el lugar en etanol (70%) para esterilizar. Deje secar al aire antes de la inserción.

Parte 2: Preparación quirúrgica

1. Procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Calgary y Cuidado de Animales del Comité de Uso y cumplir con las directrices theCanadian Asociación Laboratorio de Ciencias Animales de experimentación. Los procedimientos descritos a continuación se realizaron en adultos, ratas Sprague-Dawley (~ 300 g). Todos los procedimientos se realizan bajo el isoflurano, aunque es posible el uso de anestésicos inyectables. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizan garantizando las técnicas de asepsia. Material quirúrgico, vasos y suero salino heparinizado son esterilizados en autoclave. Guantes quirúrgicos, jeringas y aplicadores con punta de algodón esterilizado se compran al proveedor.
2. Pesar la rata y grabar el resultado. El peso será importante en el seguimiento post-quirúrgico de los animales. Sólo los animales que recuperar el peso a los niveles pre-operatorios deben ser utilizados para la experimentación. Anestesiar la rata (3% isoflurano) en una caja de anestesia. Mantener la rata a ~ 2% de isoflurano durante la cirugía con un cono de la nariz. La cirugía debe llevarse a cabo en un área de desinfección que promueve la asepsia.
3. Prepara al animal por eliminar el vello de la zona quirúrgica (cuello y hombros). Una pequeña cortadora de cabello o crema depilatoria químicos pueden ser utilizados. Realizar este procedimiento en un área separada de donde la cirugía se lleve a cabo.
4. Seguro de los animales a la mesa quirúrgica. Asegúrese de que los animales está completamente anestesiado por la comprobación de la presencia de los reflejos de los pies / los ojos. Preparar los sitios quirúrgicos con un desinfectante de la piel adecuado (70% de etanol seguido por matorrales betadine seguido de 70% de etanol).

Parte 3: Cirugía

1. Hacer pequeños de 1 cm verticales incisión media superior a la del esternón (Levante la piel longitudinalmente a lo largo del eje medial con una pinza y se corta con tijera o bisturí).
2. Blunt diseccionar con micro pinza de disección para exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo. Reflejan este músculo para exponer aproximadamente 1 cm de la arteria carótida izquierda. El uso de micro pinza de disección en la arteria carótida para mantener la arteria en su lugar. Suavemente se burlan de tejido conectivo de la arteria carótida. Es importante aislar el nervio vago de la arteria, sin dañar la arteria o el nervio. Aislar la arteria luego ligar el extremo cefálico con sutura de seda 4-0 (esto se usa para manipular la arteria carótida durante la cirugía). Nota: 4-0 suturas deben ser esterilizadas con etanol al 70% antes de su uso.
3. Sujetar el vaso con la sierra, micro disección fórceps. Pinchazo al final se liga con un calibre 21 VENOJECT Multi-muestra adaptador Luer. Retire el tapón de tubería de acero inoxidable e inserte con cuidado del catéter con la ayuda de un introductor de catéter estéril a admitirlo en la arteria. Asegurar que el catéter está segura con fórceps, en parte liberación micro pinza de disección de la arteria de sujeción y continuar la inserción del catéter a la perla. En este punto, la punta del catéter debe estar en el arco aórtico. Tenga cuidado de no liberación del catéter, la presión del recipiente lo fuerza a salir.
4. Tie dos suturas 4-0 con seguridad por debajo de cuentas y uno por encima y confirmar que el catéter se muestra. Lave la tubería con solución salina heparinizada 10U/ml. Vuelva a conectar el extremo externo del catéter con un tapón de tubería de acero inoxidable.
5. Utilizando la misma incisión, la disección roma para exponer la vena yugular externa derecha. Aislar cuidadosamente y ligar el final cefálica con sutura de seda. Practique la punción venosa con un calibre 21 VENOJECT Multi-muestra adaptador Luer. Retire el tapón de tubería de acero inoxidable e insertar catéter estéril con catheter introductor a la perla y corbata dos puntos de sutura por debajo del talón. Ate una tercera sutura por encima de cuentas y confirmar que las muestras. Ras de la vía venosa heparinizada 10U/mL solución salina. Vuelva a conectar el extremo del catéter externo con tapón de tubo de acero inoxidable.
6. Túnel de calibre 14 aguja roma en la piel y hacer la incisión en la espalda entre los omóplatos. Hilo de los catéteres a través de la aguja para exteriorizar en la parte posterior de la rata. Aproximadamente 4 cm de la línea es visible. Cortar 0,5 cm de Tygon S-50-HL Tubería médica, lugar en torno a los dos los catéteres exteriorizados y seguro con una cinta según sea necesario (para la vena azul, rojo para las arterias). Retest catéteres para asegurar la permeabilidad, de lavado y llenado con solución salina heparinizada 150U/ml para prevenir la coagulación.
7. Cierre todas las incisiones con sutura de seda 3-0. Lugar propenso rata, en la pre-calentado, jaula limpia con la comida en el fondo de la jaula.

B: Cuidado Postoperatorio

Parte 1: Cuidado postoperatorio inmediato y Monitoreo

1. Una vez que la rata recobra plena capacidad ambulatoria y el estado de alerta regreso de la rata para albergar a los animales.
2. Permita que la rata de recuperación durante 3-5 días.
3. Monitorear todos los días de la infección, dolor y cambios en el peso. La infección puede ser motivo de preocupación si la descarga de los sitios de incisión, letargo general y / o dolor que se observa. El dolor es indicado por la postura encorvada, el pelo rizado de nuevo y la ausencia de la conducta ambulatoria y / o comer. Una pérdida de peso pueden ser experimentados inmediatamente después de la cirugía hasta tres días después de la cirugía, sin embargo, el peso se estabilizará y / o aumentar en un 10% del peso antes de la cirugía dentro de 5 días. Pérdida de peso severa puede indicar una infección, accidente cerebrovascular y / o dolor.
4. Retest catéteres a diario para garantizar la permeabilidad.

Parte 2: El mantenimiento de la permeabilidad del catéter

1. Cada día durante la recuperación postoperatoria, llenar las jeringas de 1 ml Consejo Slip con solución salina heparinizada 150U/ml y la tapa con una aguja de calibre 22 contundente. La aguja de punta roma se introduce en 20 cm de tubo de PE-50 con calibre 23 de acero acoplador de tubo de acero en el otro extremo.
2. Eliminar las burbujas de aire colocando el extremo con el acoplador de la tubería más alto que el resto de la jeringa de 1 ml y empujar las burbujas fuera de la línea.
3. Abrazadera de la línea arterial externalizados de la rata con pinzas hemostáticas justo debajo del tapón.
4. Retire el tapón del catéter de acero con el segundo par de pinzas hemostáticas.
5. Introduzca el acoplador de la tubería conectada a la jeringa en la línea arterial y la liberación de la hemostatos oclusión del catéter arterial externalizados.
6. Aspirar la sangre arterial del catéter en la jeringa. Si la sonda no dibujar fácilmente puede ser necesario para empujar suavemente en una pequeña cantidad de solución de lavado a través del catéter para desalojar a la punta del catéter en caso de que se acuña contra la pared del vaso. El catéter se ha desaparecido por completo cuando la sangre llega a la jeringa.
7. Fije el cierre PE-50 tubo a la jeringa de 1 ml y desechar la jeringa. Reemplace con una nueva jeringa llena de solución salina heparinizada fresca 150U/ml. Quite la abrazadera del tubo y la celebración de la nueva jeringa en posición vertical, película de la nueva jeringa con un dedo para eliminar burbujas de aire posible nuevo hacia arriba y lejos de la línea. Nota: Se debe garantizar que las burbujas de aire pueden causar un accidente cerebrovascular.
8. Inyectar la solución salina heparinzed 150U/ml hasta la línea del catéter es clara y libre de sangre.
9. Abrazadera de la línea arterial externalizados de la rata con pinzas hemostáticas justo debajo de la tubería de acoplamiento. Quitar el conector de la jeringa de la línea del catéter arterial y sustituirlo por el tapón de tubería de acero inoxidable.
10. Suelte el hemostatos oclusión del catéter arterial externalizados.
11. Repita para la línea venosa. Sin embargo, debido a la muestreo venoso de baja presión no siempre es posible. Si la solución salina heparinzed 150U/ml puede ser infundido con una resistencia mínima, es probable que el catéter está bien colocado en la vena.

C: hiperinsulinémico euglucémico Clamp

Parte 1: Clamp Set-up y la preparación

1. Pesar la rata y registrar el peso. Esto será necesario para determinar las tasas de infusión de insulina y glucosa. Rápido de la rata, por lo menos 5 horas antes del experimento. Esto garantiza que el animal se encuentra en un estado postprandial y el aporte de glucosa a partir de fuentes de alimentación se reduce al mínimo. Lugar a la rata en un pequeño recipiente / caja con ropa de cama que limita el movimiento excesivo. El animal debe ser capaz de dar la vuelta y el novio libremente.
2. Establecer líneas y bombas de infusión como se ve en la Figura 1. P50 longitudes de tubería de conexión son los siguientes: jeringa Y conector es de 8 cm, conector en Y para ratas es de 15 cm, línea arterial es de 20 cm, y la vía venosa es de 10 cm de longitud. Retire los tapones de tubos de acero inoxidable y al ras líneas yugular y arterial para asegurarse de infusión y de muestreo, respectivamente, con solución salina heparinizada 10U/ml.
3. Determinar la insulina volumen requerido. Esto variará dependiendo del nivel de insulina y el peso de la rata. Aquí, 4mU/kg/min se administra a una velocidad de 2uL/min. Esta es una dosis fisiológica de alta. Siempre que sea posible, se debe intentar limitar el volumen de infusión. La insulina debe ser diluido apropiadamente y debe ser aplicado en presencia de plasma. Una solución de plasma de rata del 3% en solución salina se utiliza para diluir la insulina en este laboratorio. La insulina es HumulinR 100U/ml (Eli Lily), aunque otro tipo de insulina de acción rápida pueden ser empleados. Asegúrese de que la insulina diluida se mezcla bien antes de poner en la jeringa de infusión.
4. Prepare dextrosa al 50%. Esto se puede colocar directamente en la jeringa de la bomba de infusión. Marca de la bomba con "glucosa" para evitar confusiones futuras. Recuerde que debe asegurarse un volumen suficiente de insulina y glucosa para el estudio. Abrazaderas generalmente duran ~ 2h. En el presente Protocolo, las jeringas de 3 ml se utilizan.
5. Coloque la glucosa y jeringas de insulina en modelos Harvard Apparatus 11 Plus bombas de jeringa. Anticipación a la glucosa conector en Y y la línea de la abrazadera con una pinza hemostática. Avanzar a la insulina animal, pinza de acuerdo con pinza hemostática. Abrazadera de líneas y permitir que la rata para relajarse durante 30 minutos antes de comenzar el experimento. NOTA: Los protectores de punta Pinzas hemostáticas se sugieren para evitar la permanente de prensado de las líneas.
6. Prepare centrifugadora y tubos con EDTA recubiertos para la recolección de plasma. En el presente estudio, las muestras de sangre adicionales se obtendrán una vez que el animal esté sujeto.

Parte 2: Protocolo experimental

1. Una muestra de la insulina basal y la muestra de hematocrito se deben adquirir. Muestreo hematocrito asegura el volumen de sangre se mantiene durante todo el experimento. En general, los niveles de hematocrito no debería caer más del 10% del valor inicial.
2. Obtener una muestra de la glucosa basal (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) y determinar el nivel de glucosa en sangre entera para que puedan sujetarse. En este sentido, la abrazadera en la euglucemia, o 5.0-5.5mm (Figura 2). Después de cada muestra de sangre, lave la línea arterial con un pequeño volumen de solución salina heparinizada 10U/ml para prevenir la coagulación. NOTA: Asegúrese de que no hay coágulos o burbujas de aire en la línea antes de la infusión. Estos le pueden dar al animal un derrame cerebral.
3. Iniciar la infusión de insulina. Tomar la glucosa en sangre a intervalos de 5-10min, monitorización de la glucosa en cada momento. Ajustar la velocidad de infusión de glucosa como sea necesario hasta un estado de equilibrio se logra. Este proceso es generalmente un proceso de ensayo y error y puede tomar 30 minutos a> 2h. Los niveles de glucosa necesaria para mantener la glucemia dependen del protocolo experimental, las especies y las condiciones actuales (Figura 2).
4. Constante los niveles de glucosa del Estado son tres lecturas consecutivas dentro de un rango definido. Aquí, tres lecturas realizadas en ~ 1 mm se considera sujeta (por ejemplo, 4,8, 5,2, 5,6 mm). Una vez que el equilibrio se alcanza, registrar la tasa de infusión de glucosa para mantener la glucemia por un período de 30 minutos. Durante este tiempo las muestras de sangre adicionales se pueden obtener. Como mínimo, una muestra de insulina en plasma y segunda muestra de hematocrito se deben obtener.
5. Una vez que la abrazadera se ha completado, los animales pueden ser utilizados para la realización de pruebas o la eutanasia y tejidos recogidos para su posterior análisis. Dependiendo del animal, las líneas de catéter puede permanecer patente durante 5-7 días.

D: hiperinsulinémico euglucémico (insulina) Resultados Clamp

Cuando se realiza correctamente, el procedimiento de clamp evalúa la sensibilidad de la insulina estado constante de la rata. En la presentación de los datos obtenidos de la pinza, es esencial para documentar los niveles de glucosa y las tasas de infusión de glucosa. Estables los niveles de glucosa durante un transcurso de tiempo de un mínimo de 30 minutos (Figura 3) son indicativas de un estado estacionario. La glucosa se considera estable sólo si la glucosa en sangre se mantiene dentro de ~ 1 mm. Las tasas de infusión de glucosa muestran los niveles de glucosa exógena necesaria para mantener la glucemia. Siempre que sea posible, estas cifras se debe mostrar como un curso de tiempo en lugar de solo valor, en promedio (Figura 4).

Otras medidas recomendadas para ser reportados son la insulina plasmática y el hematocrito. La determinación de ambos en ayunas y se sujeta los niveles de insulina asegurar que la insulina se ha administrado con éxito y se detectaron diferencias en los niveles entre los grupos de tratamiento (Figura 5). La obtención de medidas de hematocrito al inicio y al final de la pinza de la insulina se sugieren (Figura 6). Esto es para asegurar los niveles de hematocrito no caen más del 5% durante el experimento y las alteraciones que acompañan en el volumen sanguíneo y el flujo no influyen en la utilización de glucosa.

Figura 1. Montaje experimental. La figura 1 muestra la rata sin restricciones, consciente durante el procedimiento de fijación. Los catéteres permiten tomar muestras de sangre e infusiones sin manipulación del animal. Las bombas de la izquierda contiene la insulina y la glucosa.

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Figura 2. Esperada de datos durante el procedimiento de fijación. Para obtener una abrazadera en los niveles básicos (euglucemia, 5 mm), los niveles de glucosa exógena (D50) se manipulan hasta la línea de base o "clamp" se logra.

Figura 3. Resultados esperados de glucosa en plasma del procedimiento de fijación. Cuando el animal está "sujeta", glucosa en la sangre es relativamente estable en el tiempo y los grupos experimentales.

Figura 4. Representante de las tasas de infusión de glucosa del procedimiento de fijación. La cantidad de glucosa exógena necesaria para mantener la euglucemia diferente. Esto se ilustra con un control (Chow Fed) y de alta alimentados grasa (resistencia a la insulina) los animales. Los animales alimentados con alto contenido de grasa requiere menos glucosa infundida para mantener la glucemia, sobre todo porque no es sensible a la insulina infundida.

Figura 5. Representante de insulina en plasma de la rata. La insulina en plasma durante el clamp de insulina debe ser superior a la insulina en ayunas, plasma de referencia. Esto asegura que se administró insulina adecuadamente a los animales durante el clamp de insulina.

Figura 6. Reporte de hematocrito. El hematocrito inicial y el hematocrito después del experimento debe ser obtenido y reportado. Esto asegura que los niveles de hematocrito no caen más del 5% de los niveles de referencia derivados del muestreo excesivo de la sangre arterial.

Discusión

Desarrollado inicialmente para la investigación de la sensibilidad a la insulina en los seres humanos, el procedimiento de clamp ha sido adaptada a otras especies como ratas y ratones de laboratorio. La investigación de modelos animales de resistencia a la insulina ofrece una importante ayuda en la comprensión de la fisiopatología de la sensibilidad a la insulina y patologías asociadas, así como la identificación de las intervenciones terapéuticas que tienen valor clínico ^1,2. Existen varios métodos para eval...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Tubos de polietileno Intramedic (PE-50)	Fisher Scientific	14 a 170-12B	Diámetro interno de 0.58 mm (0.023 ") de diámetro x 0.965 mm de exterior (0.038")
Dow Corning Silastic tubo de laboratorio	Fisher Scientific	11 a 189-15C	Diámetro interior de 0,76 mm (0,030 ") de diámetro x exterior de 1.65mm (0.065")
Tygon S-50-HL tubos médicos	Harvard Apparatus	PY2 72-1251	Diámetro interno de 3,2 mm (0,125 ") de diámetro x exterior de 4,7 mm (0.1875")
Loctite Super Glue	Grand & Toy	32237	Gel de control
Hoja de bisturí estéril	VWR	BD371610
Pinzas de disección curvas Micro	George Tiemann & Co.	160-20	x 2
Pinzas de disección rectas Micro	George Tiemann & Co.	160-15	x 2
Pinzas hemostáticas curvas	George Tiemann & Co.	105-1135	x 2
Pinzas hemostáticas rectas	George Tiemann & Co.	105-1130	x 2
Guardias hemostato Consejo	Robbins Instruments, Inc.	15.09-2-004
Tijeras rectas Cirugía	George Tiemann & Co.	105-402
VENOJECT Multi-muestra adaptador Luer	Terumo Medical Products	810127A	Calibre 21, de 1 pulgada
Introductor de catéter estéril	Becton Dickinson	406999
De calibre 14 aguja roma	Becton Dickinson	511310	Calibre 14, 2 pulgadas
Suturas quirúrgicas estériles	Johnson & Johnson Medical Productos	1679H	La seda, el tamaño de 3-0
No estériles de sutura quirúrgica	Angiotech Pharmaceuticals, Inc.	SP116	La seda, el tamaño de 4-0
Los hisopos de algodón	VWR	10806-005
Almohadillas de gasa 4ply	VWR	CA43845-062
Clippers de Pequeños Animales inalámbrico	Harvard Apparatus	729063
Isoflurano	Halocarbonos Products Corp.	IPN-45
Anestesia Cesta	Benson Medical Industries, Inc.
70% de etanol	Fisher Scientific	HC-1000
Betadine solución antiséptica	Occidental de distribución de drogas Centre Ltd.	105267
Modelo 11 Plus bomba de jeringa	Harvard Apparatus	702208
Acopladores de tubos de acero inoxidable	Harvard Apparatus	72-4434	Calibre 23, 0.3 pulgadas
Tubos de acero inoxidable Tapones	Harvard Apparatus	72-4436	Calibre 23, 0,5 pulgadas
Las agujas de acero inoxidable Blunt	Instech Laboratories, Inc.	LS22	Calibre 22
60 Grado Y-conectores	Partes pequeñas	STCY-22-05	Calibre 22
CritSpin Centrífuga microhematocrito	Iris Procesamiento de Muestras	CS12
Centrifugar Mini	Fisher Scientific	05-090-100
Tubos micro centrífuga	VWR	53550-778
50 ml de tubos de polipropileno centrífuga	VWR	89004-364
1 ml jeringas de plástico de deslizamiento Consejo	Becton Dickinson	309602
3 ml de plástico Luerlok jeringas Consejo	Becton Dickinson	309585
Inyección anticoagulante heparina	Occidental de distribución de drogas Centre Ltd.	102824	Fabricante: LEO Pharma Inc. Conc. 1000 UI
EDTA	Promega Corp.	V4231	0,5 M, pH 8,0
Salina	Occidental de distribución de drogas Centre Ltd.	ABB7983154	Fabricante: Hospira al 0,9%
Dextrosa al 50%	Vetoquinol	8DEX012D
Humulin-R	Eli Lilly	HI-210	100U/ml
Las jeringas de 1 ml de insulina	Becton Dickinson	309311
Fisherbrand * Hemato-Seal Sellador	Fisher Scientific	02-678
Fisherbrand * Tubos capilares microhematocrito	Fisher Scientific	22-362-574
One Touch Strips ultra de prueba	LifeScan, Inc.	AW 085-314H
One Touch ultra medidor de glucosa en la sangre	LifeScan, Inc.	AW 085-314b
Sodio Pentobarbitol	CEVA Santé Animale	1715 138	Conc. 54.7mg/ml
Red Tape Laboratory de etiquetado	VWR	89097-932
Laboratorio de Etiquetado de cintas azules	VWR	89097-936
Báscula	Fisher Scientific	01-913-88
Vórtice	VWR	58815-234
Temporizador	VWR	62344-641