Mediciones y la aplicación directa de las fuerzas sobre las neuronas en el rango de Microdyne 2000-1000 se logran con alta precisión utilizando agujas de vidrio calibrado. Esta metodología se puede utilizar para controlar y medir varios aspectos del desarrollo axonal, incluyendo la iniciación axonal, la tensión axonal, la velocidad de elongación axonal, y vectores de fuerza.
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Artículo de método
La manipulación mecánica de las neuronas para controlar el desarrollo axonal
En este artículo
Resumen
Resumen
Manipulación de células y la extensión de los axones neuronales se puede lograr con vidrio calibrado micro fibras capaces de medir y la aplicación de fuerzas en el rango de 1,2 10-1000 μdyne. Las medidas de fuerza se obtienen mediante la observación de la Hookean flexión de las agujas de cristal, que son calibrados por un método directo y empírico 3. Necesidades de equipo y procedimientos para la fabricación, la calibración, el tratamiento y el uso de las agujas de las células se describen con detalle. La fuerza de los regímenes anteriores, los diferentes tipos de células a las que estas técnicas se han aplicado pruebas de la flexibilidad de la metodología y se dan como ejemplos para la investigación futura 4.6. Las ventajas técnicas son las continuas 'visualización' de las fuerzas producidas por la manipulación y la capacidad de intervenir directamente en una variedad de procesos celulares. Estos incluyen la estimulación directa y regulación del crecimiento axonal y la retracción del 7, así como el desprendimiento y mediciones mecánicas en cualquier tipo de cultivo celular 8.
Protocolo
1. Que las agujas de cristal.
- Un ajuste de micro-aguja extractor se utiliza para la fabricación de agujas con punta cónica de 4 mm de longitud y que se cierran las vigas sólidas. A diferencia de una punta larga y flexible, este corto 4 mm de largo los límites de las vibraciones de la punta de la aguja durante los experimentos. En la región proximal de la fibra de 4 mm, la aguja se estrecha rápidamente a partir del diámetro del tubo de vidrio a 15 micras dentro de 1 mm, mientras que la más distal de 1 mm de la fibra es de 2,5 micras de diámetro. Usamos R-6 tubo de vidrio capilar, 0,9 mm OD, ID 0.6 mm de longitud 8 "y un extractor de BB-CH. Si el investigad....
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Discusión
Técnicas a aplicar y medir fuerzas celulares tienen una larga historia 9. Nuestro método fue motivada inicialmente por el trabajo de Dennis Bray, que utiliza agujas de vidrio similar a la nuestra a 'remolque' las neuronas a un ritmo constante, utilizando un dispositivo motorizado hidráulico 10. Hay muchos medios alternativos de la aplicación de fuerzas a las células que son: motores paso a paso 11, 12 bolas magnéticas, rayos microfabricated 13 y los flujos de fluidos <.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos las importantes contribuciones del Dr. Robert E. Buxbaum en el desarrollo de esta metodología.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo capilar R-6 | Drummond Scientific | 9-000-3111 | Tubo de vidrio R-6, OD 0,9 mm, ID 0,6 mm, 8" |
| Extractor BB-CH | Mecanex S.A., Ginebra, Suiza | BB-CH puller | Utilice el modo 4 Alt con CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| Alambre de cromel 0,001" | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | Alambre para termopar sin funda, carrete de 50 pies, ahora llamado Chromega |
| Alambre de constantán 0,003" | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | Alambre para termopar sin funda, carrete de 50 pies |
| Pinzas finas | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox n.º 5 |
| Soporte universal para microscopio con brazo articulado | Nikon Instruments | 76135 o 90430 | La mayoría de las marcas o tipos de soportes con brazo articulado funcionarán para este uso |
| Micromanipulador mecánico | Narishige International | M-152 | Micromanipulador grueso de accionamiento directo de tres ejes |
| Micromanipulador hidráulico | Narishige International | MO-203 | Ahora disponible como MMO-203, tipo de tres ejes móviles |
| Portaabrazaderas | Leica Microsystems | 11520145 | Juego de 3 |
| Soporte individual para instrumentos | Leica Microsystems | 11520142 | |
| Soporte doble para instrumentos | Leica Microsystems | 11520143 | |
| Micromanipulador mecánico | Leica Microsystems | 39430001 | Montaje sobre poste, 1 soporte para probeta, modelo RH 430001 |
| Micromanipulador mecánico con joystick | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | Microscopio invertido | |
| Mesa de aislamiento Vibraplane | Kinetic Systems | serie 1200 | El nuestro es el modelo 1201-02-12 |
| Ringcubador | Hecho en casa (ver referencia 19) | Referencia 19, requiere el controlador actualizado que se indica más abajo | |
| Controlador de temperatura programable | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | Sustituye al controlador de temperatura PXV3 retirado |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | Microscopio invertido, aproximadamente de 1980 | |
| Nikon SMZ-10, binocular para disección | Nikon Instruments | Otros microscopios para disección funcionarán |
Referencias
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. <....
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Reimpresiones y permisos
