El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

Resumen

Una manera de estudiar la integración de los recién nacidos las células granulares dentadas en los animales adultos se describe. Esta técnica utiliza un retrovirus modificados para etiquetar las neuronas recién nacidas, seguido por los registros electrofisiológicos para determinar la integración funcional en vivo.

Resumen

Neurogénesis ocurre en adultos cerebro de los mamíferos en la zona sub-ventricular (SVZ) del ventrículo lateral y en la zona sub-granular (SGZ) de la circunvolución dentada del hipocampo durante toda la vida. Estudios previos han mostrado que la neurogénesis del hipocampo adulto se asocia con trastornos cerebrales diversos, como la epilepsia, la esquizofrenia, la depresión y la ansiedad (1). Descifrar el proceso de integración de las neuronas normales y aberrantes de adultos nacidos pueden arrojar luz sobre la etiología de estas enfermedades e informar el desarrollo de nuevas terapias.

Neurogénesis adulta SGZ espejos desarrollo neuronal embrionario y postnatal, incluyendo las etapas de especificación de destino, la migración, la integración sináptica, y la maduración. Sin embargo, la plena integración se produce durante un prolongado período de 6 semanas. Entrada inicial sináptica de adultos nacidos en las células granulares SGZ dentado (PED) es GABAérgicas, seguido por la entrada glutamatérgica a los 14 días (2). Los factores específicos que regulan la formación de circuitos de adultos nacidos en las neuronas del giro dentado se desconoce en la actualidad.

Nuestro laboratorio utiliza una replicación deficiente vector retroviral basado en el virus de la leucemia murina Moloney para entregar las proteínas fluorescentes y la hipótesis de los genes reguladores de estas células en proliferación. Esta técnica ofrece una alta especificidad viral y la resolución para el análisis de la fecha de nacimiento de células, el linaje, la morfología y sinaptogénesis.

Un experimento típico emplea a menudo dos o tres tipos de virus que contiene la etiqueta única, los transgenes, y los elementos promotores de una sola célula de análisis de un proceso de desarrollo deseado en vivo. El siguiente protocolo describe un método para el análisis de la integración funcional de las neuronas recién nacido con un único color verde (GFP) o rojo (dTomato) retrovirus proteína fluorescente y patch clamp-electrofisiología.

Protocolo

1. Virus de la inyección

Alto título de retrovirus modificados (1 x 10 ⁹ unidades / ml) es producida por la co-transfección de vectores retrovirales y VSVG en las células HEK293T, seguido por ultracentrifugación de sobrenadante viral. Para las fuentes y los métodos de producción, de ver la demostración JoVe excelente (3).

Nota: adultos jóvenes (4-6 semanas de edad) mujeres ratones C57BL / 6 (Charles River) se encuentran en condiciones normales. Todos los procedimientos siguen la guía del Consejo Nacional de Investigación para el cuidado y uso de animales de laboratorio bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Stony Brook IACUC.

1. 2UL deshielo de los retrovirus por animal congelado en el hielo.
2. Anestesiar (100 mg de ketamina + 10 xilazina microgramos por gramo de peso corporal) y montar el animal en un marco estereotáxico (Steolting). Quitar el pelo en la cabeza y limpiar la piel con etanol al 70%.
3. Exponer el cráneo y perforar cuatro pozos someros con un taladro dental (broca de 0,6 mm) en las siguientes coordenadas:
   • anterioposterior = -2 mm de bregma, lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = 3 mm de bregma, lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm.
   • anterioposterior = -2 mm de bregma, lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = 3 mm de bregma, lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm.
4. Montar un Hamilton 1μl, plana punta de la jeringa e inyectar 0,5 l por retrovirus lugar a una tasa de 0,25 l / min en el giro dentado. (Ver las coordenadas por encima de la profundidad ventral.) Pausa 2 minutos después de cada inyección antes de retirar la jeringa lentamente para evitar el reflujo de líquido. Entre las inyecciones, una breve aclaración de la superficie externa de la punta de la jeringa con PBS estéril y un aplicador para eliminar los rastros de sangre.
5. Cerrar la herida con material estéril sutura quirúrgica (tipo P-1; Tamaño 6-0) y devolver el animal a las condiciones de vivienda estándar hasta las etapas de tiempo deseado después de la inyección.

2. Preparación Cortar

Para obtener cortes de alta calidad aguda de ratones adultos, se utiliza una solución de corte modificado para la preparación de corte (ver más abajo).

1. Pre-corte chill solución a 0-4 º C en el hielo y la burbuja con un 95% de O ₂ -5% de CO ₂ por lo menos durante 30 minutos.
2. Anestesiar y transcardially perfundir un animal con helado de oxígeno de una solución saturada de corte.
3. Quite rápidamente el cerebro en un petri plato con papel de filtro pre-humedecido con una solución fría, oxigenada de corte. Cortar el cerebelo y la porción de una superficie de montaje de al menos 1 mm anterior a las coordenadas de la inyección (visible). Pegue el cerebro en una etapa vibrotome y montarlo en la cámara de corte llena con una solución de corte en frío y oxigenado.
4. Prepare cortes coronales u horizontal (300-350μm) y la transferencia con una pipeta de mayor diámetro para una cámara de incubación a temperatura ambiente que contiene ACSF burbujas con un 95% O ₂ / 5% CO _2.
5. Incubar los cortes, burbujas de forma continua, a 32 ° C durante 30-60 minutos. Devolver la cámara a temperatura ambiente durante la duración de la grabación.

3. Los experimentos electrofisiológicos

1. Los sectores se transfieren a la cámara de grabación que está continuamente perfundidos con ACSF saturada de oxígeno a 32 ° C - 34 ° C.
2. Un electrodo de estimulación bipolar de tungsteno se coloca en la capa molecular del giro dentado con un objetivo de microscopio óptico bajo (10 veces).
3. PED recién nacido en la zona sub-granular / capa de células granulares se identifican por la expresión de GFP o dTomato. De células enteras de grabación patchclamp se realiza en las neuronas recién nacidas bajo aumento (40X).
4. Propiedades de disparo de las células registradas se obtienen mediante la inyección de una serie de corrientes en el modo actual-clamp.
5. Estímulos eléctricos son entregados por el electrodo de estimulación a través de un aislador de la estimulación controlada por el software de grabación, y evocó las corrientes postsinápticas en el PED recién nacidos se registran.

4. Análisis de Datos

Amplitudes de las respuestas evocadas postsináptica se analizan en las distintas fases de los adultos nacidos en las neuronas.

5. Resultados representante

Utilizando el protocolo anterior, la expresión de GFP en el recién nacido neuronas giro dentado similar a la Figura 1 es común. Tenga en cuenta que las neuronas recién nacidas que es fácil ver y tanto dendritas y los axones están marcados con firmeza. Expresión en los axones delgados DGC y pequeñas espinas depende de la calidad y el título del virus, el promotor utilizado y la longitud de la expresión in vivo. En nuestras manos, las células del recién nacido y orgánulos subcelulares son generalmente visibles a los pocos días después de la inyección, y la expresión de la columna vertebral puede ser rastreado desde las primeras etapas de desarrollo. Wcélula-agujero grabaciones de las neuronas recién nacidas en las etapas de tiempo diferentes permitir el estudio de propiedades únicas células del recién nacido, por ejemplo, los potenciales de acción (figura 2a), así como el proceso de integración sináptica en los actuales circuitos neuronales durante la maduración (Figura 2b).

Figura 1 de 2 fotones imagen confocal de neuronas recién nacidas en una sección horizontal de giro dentado de un ratón adulto. Las células verdes son 21dpi (días después de la inyección) que expresan GFP PED recién etiquetados con PUX-GFP retrovirus.

Figura 2 a, b) Potencial de acción disparando propiedades de un recién nacido DGC a los 21 dpi.) Representante evocó excitatorios postsinápticos corrientes (EPSCs) grabado en un recién nacido DGC a los 21 dpi.

Discusión

Neurogénesis continua en el hipocampo de cerebros de los mamíferos adultos proporciona un sistema único modelo experimental para estudiar el desarrollo y la integración neuronal en el cerebro maduro. El protocolo se presenta aquí combina etiquetado retrovirales y métodos electrofisiológicos para estudiar la integración de los recién nacidos las neuronas granulares dentadas en los cerebros de ratones adultos.

Para asegurarse de que sus experimentos tienen éxito, se recomienda lo siguiente durante las etapas críticas del procedimiento:

Para evitar la infección y la inflamación no deseados, todos los instrumentos deben ser esterilizados (por autoclave, cualquier tipo de esterilización, o el 70% de etanol) antes de la cirugía. Use PBS estéril para lavar la punta de la aguja de la jeringa antes de la inyección.

Para la inyección de virus, los animales deben estar bien montado en el dispositivo estereotáxico y fuentes de los movimientos innecesarios deben ser minimizadas durante la inyección. Asegúrese de que la cabeza está bien fijo y firme, y ajustar la posición de la nariz del ratón a nivel de bregma y lambda antes de la inyección de cálculo de coordenadas. Extracto de virus en la jeringa rápidamente para minimizar la exposición a temperatura ambiente - Los retrovirus son particularmente sensibles a la temperatura. Inyectar lentamente virus en la dosis recomendada para minimizar el daño de presión. Uso de la recomendada de punta plana jeringa (vs. punta biselada común) se asegurará una distribuida uniformemente zona dentada infección giro.

Antes de preparar las rebanadas, corte de la solución y la incubación de ACSF se burbujea con un 95% de CO ₂ O ₂ al 5% por lo menos 30 minutos para permitir que el oxígeno para saturar las soluciones. Los animales deben ser perfundidos con rapidez y mantener el tejido en frío, saturada de oxígeno solución para la mejor calidad de corte.

Para la grabación, aumento de la intensidad del estímulo gradualmente hasta que haya una respuesta postsináptica. Cambiar la ubicación de los electrodos de estimulación en la capa molecular del giro dentado según sea necesario.

En resumen, el enfoque recomendado ofrece una manera de explorar distintas propiedades y posible papel funcional de los adultos nacidos en las neuronas durante las primeras etapas de integración en los circuitos activos, maduros.

Materiales

• Solución de corte (en mm): 110 cloruro de colina, 2,5 KCl, 1,3 KH ₂ PO _4, 25,0 _NaHCO3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 de dextrosa, 1.3 ascorbato de sodio, 0,6 piruvato de sodio, ácido 5,0 quinurénico.
• Artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF, en mM): NaCl 125,0, 25,0 _NaHCO3, 2,5 KCl, 2 CaCl _2, 1,3 KH ₂ PO _4, 1,3 MgCl _2, 1,3 ascorbato de sodio, 0,6 piruvato de sodio, 10 de dextrosa.
• Solución interna de células enteras patchclamp (en mM): 120 gluconato de potasio, KCl 15, 4 MgCl _2, 0,1 EGTA, HEPES 10,0, 4 MgATP, 0,3 Na ₃ GTP, 7 fosfocreatina (pH 7,4, 300 mOsm).