Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

Resumen

Una demostración formal de la disección de un ojo del ratón, lo que resulta en un montaje de todo el epitelio pigmentario de la retina.

Resumen

El epitelio pigmentario retiniano (EPR) se encuentra en la parte posterior del ojo de los mamíferos, justo debajo de la retina neural, que contiene los fotorreceptores (conos y bastones). El EPR es una monocapa de células pigmentadas cúbicas y asociados estrechamente con la retina neural justo encima de él. Esta asociación hace que el RPE de gran interés para los investigadores que estudian enfermedades de la retina. El EPR es también el sitio de un ensayo in vivo de la homología dirigida por la reparación del ADN, la prueba de p ^{de la ONU.} El ojo del ratón es particularmente difícil de analizar debido a su pequeño tamaño (alrededor de 3,5 mm de diámetro) y su forma esférica. En este artículo se demuestra con todo detalle un procedimiento para la disección del ojo que resulta en un montaje conjunto de la RPE. En este procedimiento, se muestra cómo trabajar con y no contra, la estructura esférica del ojo. En pocas palabras, el tejido conectivo, el músculo y el nervio óptico se eliminan de la parte posterior del ojo. Luego, la córnea y el cristalino se eliminan. A continuación, se hacen cortes estratégicos que dan lugar a aplanamiento significativo del tejido restante. Por último, la retina neural se levanta suavemente, dejando al descubierto un EPR intacto, que aún está unido a la coroides y la esclera subyacente. Este monte se puede utilizar para realizar el ensayo ^{de la ONU} o p para la evaluación de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia el tejido de RPE.

Protocolo

1. Eliminar el tejido extraños desde el exterior del ojo

1. Vierta 1X PBS en la tapa de un plato de 35 mm. El nivel debe estar justo debajo del labio de la tapa.
2. El uso de pinzas rectas, los ojos de transferencia (s) del tubo de almacenamiento para el plato de 35 mm. Los ojos se sumergen en PBS, por dos razones: 1. Los tejidos extraños "flotan" fuera del ojo para que pueda ver y quitar con facilidad, y 2. Durante la disección, los ojos, naturalmente, mantienen su forma esférica, mientras que en la suspensión, que le permite trabajar con esta forma en lugar de combatirla.
3. Utilizando los dos pares de pinzas en ángulo (45 ° y 15 °), retire su....

Discusión

El EPR es el sitio de la prueba de p ^{de la ONU,} un ensayo in vivo de la homología dirigida reparación. El ensayo de p ^{de la ONU} ha sido utilizado para estudiar los efectos de los daños del ADN diferentes ^1,2 y señalización daño en el ADN y los genes de reparación ^3,4,5 de la frecuencia de homología dirigida reparación. Este ensayo es muy sensible, la detección de una sola célula eventos en el RPE ^1. También puede detectar diferencias en el.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pinzas rectas	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4903	punta: .08 x .04 mm material: INOX
pinzas de 45°	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	punta: .05 x .01 mm material: INOX
pinzas de 15° "hacia arriba"	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045A	punta: .1 x .06 mm material: INOX
tijeras de resorte	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5604	ancho de punta combinada 0,3 mm, longitud del filo de corte 3 mm, material: acero inoxidable
microscopio estereoscópico binocular	Carl Zeiss, Inc.	Discovery V.8	usar fuente de luz reflejada
faloídicina	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546