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Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

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DOI:

10.3791/2581

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7 de junio de 2011

 , 
1Department of Physiology, Brody School of Medicine, East Carolina University

En este artículo

Resumen

Numerosas manipulaciones genéticas y / o inyecciones intramiocárdica de genes, proteínas, células, y / o los biomateriales se superponen a la dimensión del tiempo en los estudios de agudos de isquemia / reperfusión y la remodelación crónica en ratones. Este video ilustra los procedimientos de microcirugía de la isquemia / reperfusión, la ligadura permanente de la arteria coronaria, y los estudios de inyección intramiocárdica.

Resumen

Los modelos de ratón son una herramienta valiosa para estudiar la lesión aguda y la remodelación crónica del miocardio in vivo. Con la aparición de modificaciones genéticas en el organismo completo o en el miocardio, así como una variedad de materiales biológicos y/o sintéticos, existe un gran potencial para que cualquier combinación de estos factores atenúe la magnitud de la lesión isquémica aguda y retrase el inicio de la insuficiencia cardíaca consecuente a la remodelación miocárdica.

Aquí presentamos los métodos y materiales utilizados para realizar de forma confiable esta microcirugía, así como las modificaciones necesarias para estudios de oclusión coronaria temporal (con reperfusión) o permanente, además de inyecciones intramiocárdicas. Los efectos sobre el corazón que pueden observarse durante el procedimiento y al finalizar el experimento, junto con la evaluación histológica, verificarán la eficacia.

Brevemente, la preparación quirúrgica consiste en anestesiar a los ratones, eliminar el vello del tórax y desinfectar luego el área quirúrgica. La intubación intratraqueal se realiza mediante iluminación transesofágica utilizando una luz de fibra óptica. A continuación, se conecta el tubo a un ventilador. Una incisión en el tórax expone los músculos pectorales, que se cortan para visualizar las costillas. Para estudios de isquemia/reperfusión, se utiliza un trozo de 1 cm de tubo de polietileno colocado sobre el corazón para atar el ligadura, de modo que la oclusión y la reperfusión puedan personalizarse. Para inyecciones intramiocárdicas, se emplea una jeringa Hamilton con aguja estéril biselada de calibre 30. Cuando las manipulaciones miocárdicas han finalizado, se cierran secuencialmente la caja torácica, los músculos pectorales y la piel. La analgesia por bloqueo de línea se realiza con marcaina al 0,25 % en solución salina estéril, que se aplica sobre la capa muscular antes del cierre de la piel. A los ratones se les administra una inyección subcutánea de solución salina y se colocan en una cámara de calentamiento hasta que estén en posición esternal. Posteriormente, se devuelven al bioterio y se mantienen en condiciones estándar hasta el momento de la recolección de tejidos. En el momento de la eutanasia, se anestesian a los ratones, se detiene el corazón en diástole con KCl o BDM, se enjuaga con solución salina y se sumerge en fijador. Posteriormente, se realizan los procedimientos rutinarios de procesamiento, inclusión, corte y tinción histológica.

La intubación no quirúrgica de un ratón y las manipulaciones microquirúrgicas descritas convierten este modelo en uno técnicamente difícil de aprender y reproducible. Estos procedimientos, combinados con la dificultad para realizar manipulaciones consistentes del ligadura para oclusiones temporizadas y reperfusión o inyecciones intramiocárdicas, también pueden afectar la tasa de supervivencia, por lo que la optimización y la consistencia son fundamentales.

Protocolo

  1. Instrumentos quirúrgicos estériles (Tabla 1) y 3 "aplicadores con punta de algodón se colocan en una underpad estéril. El esterilizador de cuentas (Germinador 500) está encendido.
  2. Ratones (edad:> 6 semanas; peso:> 18 g) se anestesiaron con una inyección ip de 20μl / g de peso corporal de tribromoethanol (250mg/kg; duración - aproximadamente 40 minutos).
  3. Cuando los ratones no responden a los pies-una pizca, un lubricante estéril (Lágrimas renovado) se aplica a los ojos para protegerlos de la desecación y el lado izquierdo del pecho está cubierto con crema depilatoria (por ejemplo, Nair) para eliminar el pelo de la piel.
  4. La depilación se lava con agua tibia y betadine / alcohol hisopado se utiliza para desinfectar el área quirúrgica.
  5. El ratón es colocado en una almohadilla caliente deltaphase isotérmica que se fija a una mesa de plexiglás. Cada miembro es inmovilizado con cinta adhesiva y un hilo grueso se coloca horizontalmente bajo los dientes de arriba para mantener la mandíbula superior en su lugar.
  6. La tabla está en posición vertical y una luz de fibra óptica se ilumina directamente sobre la zona del cuello para la iluminación transesofágica. Esto requiere la colocación precisa de tal manera que la apertura de la garganta es visto como un orificio bien iluminada, lo que permite la tráquea para ser visualizados para facilitar la inserción de la tubería de PE.
  7. El tubo se conecta al ventilador (conectado a un 95% O 2 / 5% CO 2) para administrar ventilación a presión positiva constante (TOPO ventilador, tasa de 125 respiraciones / min; pico de presión inspiratoria 10-12 cmH 2 O; nota * : Los ajustes varían con la cepa y el sexo 1-3). Una vez que la ventilación es confirmado por los movimientos del tórax sincronizado, la conexión se fija a la plataforma con cinta adhesiva para evitar la extubación durante la cirugía.
  8. Con unas pinzas dentadas para tirar de la piel hacia arriba y lejos del pecho, una hoja de bisturí # 10 estéril conectada a un mango de bisturí n º 3 se utiliza para hacer una incisión de 1,5 cm en la piel paralelo al esternón.
  9. Curva microtijeras Vanna se utilizan para cortar los músculos pectorales y hacer un pequeño agujero en el músculo intercostal.
  10. Recta, micro tijeras romas se utilizan para cortar a través de tres costillas.
  11. El espéculo de 9 mm oftálmica pediátrica se utiliza para retirar la caja torácica.
  12. Utilizando la pinza curva, tirar el pericardio desde el corazón y el uso de las pinzas dentadas para arrancar suavemente abierta.
  13. Utilizando el porta-agujas Castroviejo, un punto cónico de 6 mm 3 / 8 hilos de la aguja de la sutura de polietileno de 8-0 por debajo de la descendente anterior izquierda arteria coronaria (a lo largo del eje longitudinal del corazón) perpendicular a ella.
    1. Para una ligadura temporal que puede ser eliminado debido a que la reperfusión tiempo, un estéril 0.5-1cm pedazo de PE90 se coloca en el corazón de forma paralela a la arteria coronaria. La sutura, que haya sido enrollado debajo de la arteria coronaria, se ata a la tubería. En el momento en que va a ser liberado, la ligadura se afloja. Esto se puede repetir si lo desea y el tiempo de oclusión / reoclusión puede ser modificado 4. Dependiendo de la duración del protocolo y el tipo de anestesia utilizada, la suplementación puede ser necesaria.
    2. Para una oclusión permanente, la ligadura atada debajo de la arteria coronaria es simplemente atados. Escaldado y discinesia son evidentes y el extremo largo de la sutura se corta 5.10.
    3. Para la inyección intramiocárdica (s), una jeringa estéril de Hamilton con una aguja estéril de calibre 30 biselados se introduce en la base del corazón por encima de la zona de la lesión en el lado derecho de la ligadura. La aguja se avanzó hacia la zona de la lesión y se retira un poco para que el bisel se puede ver aproximadamente en la zona fronteriza. Parte de la solución en la jeringa (2-3μl) se inyecta en el corazón y la aguja se mantiene en su lugar. La jeringa se retira otro de 1-3mm y el resto de la solución se inyecta. La jeringa se mantiene en su lugar hasta que la ampolla que se forma por la solución se disipa. La aguja se retira. Si hay algún sangrado, un aplicador de algodón se presiona suavemente sobre el sitio de inserción de la aguja hasta que el sangrado se detiene 5-7.
  14. Una vez que las manipulaciones de miocardio se han completado, los retractores de la costilla se eliminan y la cavidad torácica se cierra con 3.2 puntos de colchonero con sutura 6-0 Surgipro.
  15. Dos y tres puntos de colchonero se hacen a cerca de los músculos pectorales, 1-3 gotas de bupivacaína al 0,25% 1:10 en solución salina estéril (ratón 0.1ml/25g) se aplica a los músculos y luego 2-3 puntos de colchonero se hacen para cerca de la piel.
  16. El ratón se retira del ventilador. Una vez que la respiración rítmica, rápida y superficial, se ha verificado, el ratón puede ser extubado.
  17. 0,5 ml de solución salina estéril caliente se inyecta en el espacio subcutáneo dorsal y el ratón se coloca sobre una plataforma de calentamiento en una jaula hasta que recupera la movilidad (1 hora mínimo).
  18. Para los experimentos de supervivencia, los ratones se vuelven a colocar en sus jaulas y se devuelve al vivero hasta el momento del sacrificio. Durante los 2 primeros días, se humedece los alimentoscolocado en el piso de la jaula para facilitar la alimentación (por lo que no tiene que llegar hasta lo que puede causar dolor) y la buprenorfina debe ser administrado cada 6 de 12 horas. Atención post-operatoria también incluye el monitoreo diario de la primera semana para verificar una adecuada movilidad, el aseo y los hábitos alimenticios.
  19. Los instrumentos quirúrgicos son limpiados con etanol y se inserta en el esterilizador de cuentas antes de la operación siguiente.
  20. En el momento del sacrificio, los ratones se anestesian con pentobarbital sódico (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Cuando un plano de anestesia adecuado se logra, la cavidad torácica se abre.
  21. Mientras el corazón sigue latiendo, una jeringa con una aguja de calibre 23, que contienen cloruro de potasio en frío (KCl, 30 mM) o 2,3-butanodiona monoxima (BDM, 10 mM) se utiliza para perforar la región basal posterior del ventrículo y la solución es se inyecta lentamente en la cámara hasta que el corazón es detenido en diástole.
  22. Una vez que el corazón se retira, una jeringa que contenía PBS se utiliza para perfundir retrógradamente el corazón de enjuague para eliminar la sangre que queda. Para estudios de toxicidad aguda, al final del período de reperfusión, el muchacho se re-liga en el punto original de la oclusión. Una solución que contiene 1% de azul de Evans se inyecta en la aorta. Una vez que el corazón se extrae, se corta transversalmente en tres secciones de igual grosor, se incubaron en 1% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio, y la imagen de los análisis morfométricos 11. Para estudios de toxicidad crónica, el corazón se sumerge en el fijador, procesados ​​y embebidos de acuerdo a los procedimientos de rutina. Las diapositivas se pueden teñir histológicamente y con imágenes para el análisis morfométrico (con Scion, NIH Image J, o Image Pro Plus) 9,10,12.

Los resultados representativos:

Cuando se hace correctamente, las tasas de supervivencia en ratones (machos: 8-10 semanas de edad, 22-28g; mujeres: la edad de 10-12 semanas, 20-26g) son: más del 90% en aguda por isquemia / reperfusión isquémica y experimentos de precondicionamiento, en 85% en los estudios de la arteria ligadura permanente, y aproximadamente el 80% para inyección intramiocárdica. Desde temprana lesión es más fácilmente visible por los cambios metabólicos en lugar de la determinación estructural, el tamaño del infarto en la isquemia / reperfusión y la cardiopatía isquémica experimentos pre-acondicionamiento se realiza mediante la infusión de 1% de colorante azul de Evans en la aorta que perfundir el corazón que no es suministrado por la DA ( Figura 1 A). Una vez que el corazón y cortadas transversalmente por la mitad, el tejido se incuba en el 1% de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio para medir el tamaño del infarto (fig. 1B). Las áreas se miden con Scion o NIH software de imágenes que puede ser calibrado usando un micrómetro de imágenes con el mismo aumento. Estos números se utilizan para calcular el área de riesgo / ventrículo izquierdo y el tamaño del infarto / área de riesgo 11. Diferencias de las cepas puede dar lugar a variaciones en el peso corporal y el tamaño del corazón y por lo tanto se debe tener cuidado para normalizar las medidas de peso del corazón, el peso corporal, o la longitud de la tibia con fines comparativos.

Permanente resultados ligadura de la arteria en grandes cambios estructurales, tales como necrosis, adelgazamiento de la pared, y la dilatación de la cámara. La comparación de los efectos del tratamiento y / o tiempo en el tamaño del infarto y necrosis en relación con el ventrículo izquierdo, área de la cámara, y el espesor de la pared septal del ventrículo izquierdo de la pared libre en el modelo de oclusión permanente (Figura 2) también se puede medir con Scion o imágenes de NIH software. Tinción de colágeno con picrosirius rojo / verde rápido (Figura 2B) se puede utilizar para medir la fibrosis intersticial que se correlaciona con los índices funcionales de 8-10 rigidez de la pared. La imagen en la figura 3 se representa la distribución de la solución de 6ul (azul de Evans) se inyecta en la zona fronteriza del corazón después de la ligadura arterial permanente. Tenga en cuenta que procede en la dirección de la lesión, así como hacia la base y también transmural.

Figura 1
Figura 1. A. Evan 's azul se inyecta en la aorta antes de la escisión. Esta imagen muestra las regiones de perfusión del corazón (manchado) y la zona ocluida (sin manchas). Evan B.' s azul y manchas TTC siguientes efectos agudos de isquemia / reperfusión. Esta es una imagen representativa (20x) que muestra la distribución del colorante azul que se tiñe las regiones sin oclusión, así como la tinción de tejido viable TTC metabólicamente (rojo). Áreas necróticas no mancha y lo que se mantienen pálido (contorno).

Figura 2
Figura 2. A. hematoxilina y eosina. Se trata de una imagen representativa (20x) de la tinción H & E de un corazón de ratón cortada transversalmente a través de la región del infarto a los 4 días post-infarto (20x). * Denota la necrosis de los tejidos, las flechas apuntan al tejido de granulación, RV = ventrículo derecho y ventrículo LV = izquierda. B. Picrosirius rojo y verde rápido mancha. Este es unLa imagen (20x) de picrosirius rojo / verde tinción rápida de una sección transversal de corazón de ratón a las 4 semanas post-infarto de miocardio. El verde citoplasma manchas y fibras de colágeno son de color rojo.

Figura 3
Figura 3. Azul distribución del colorante de Evan mancha después de la inyección intramiocárdica 6ul. Esta es una imagen representativa que muestra la distribución global y transmural del colorante azul de Evans a través del corazón después de la inyección intramiocárdica 6ul en la zona de frontera inmediatamente después de la ligadura de la arteria coronaria (12x).

Discusión

La enfermedad coronaria sigue siendo un método epidemiológico y fiscalmente problema de salud pública. La investigación básica sigue siendo considerable para comprender los mecanismos por los que las lesiones y remodelación proceder y cómo terapéuticos potenciales pueden modular estos procesos para que puedan ser desarrollados para su uso clínico. Los roedores son los más utilizados y la amplia gama de ratones modificados genéticamente, consigue de esta especie un modelo más atractivo.

Aunque hay diferencias entre los ratones y otras especies, hay muchas ventajas para un modelo murino. El uso de un ámbito sencillo de disección o una lupa y las condiciones de buena iluminación permitirá a la vasculatura para ser visto con facilidad (por la anatomía detallada bruto de la vasculatura, véase Salto-Téllez et al., 2004 13). Para reducir el riesgo de mortalidad postoperatoria, es muy importante para evitar la ruptura de grandes vasos ya que el volumen total de sangre de un ratón de 25 g es menor de 2 ml 14. En el caso de que la hemorragia excesiva, aplicación suave de la presión o cauterización señalar se puede utilizar para detener el sangrado.

Este procedimiento también puede ser modificado en una variedad de maneras. Por ejemplo, los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano, la ketamina / xilazina, o pentobarbital sódico y la selección apropiada es determinada por la duración del protocolo de 15-18. El reflejo de los pies-pinch es el índice más utilizado de la profundidad de la anestesia. Además, para mejorar la probabilidad de supervivencia a largo plazo, algunos investigadores utilizan fármacos antiarrítmicos como la lidocaína para reducir la incidencia de arritmias letales 19,20 sin embargo, debe tenerse en cuenta que este ha sido recientemente demostrado tener propiedades anti-apoptóticas en una aguda modelo 21. Además, para reducir el dolor postoperatorio, los analgésicos como la buprenorfina puede ser administrada durante las primeras 48 horas después de la cirugía 3,16,17,22,23. Para mantener la temperatura corporal durante la cirugía (especialmente para los más protocolos), una sonda rectal en serie con un cojín de la calefacción es a menudo usado en lugar de la almohadilla isotérmica. De la isquemia / reperfusión / o pre-isquémica o poscondicionamiento: la duración de la oclusión (s) y la reperfusión (s) puede ser alterado;; para oclusión permanente, el tamaño del infarto puede ser modificado mediante el ajuste de la ubicación de la ligadura y para inyección intramiocárdica (por ejemplo, células, proteínas), no puede haber lugares 1.3 de inyección y el volumen por inyección puede ser de hasta 15 l 24. Si las células se inyectan, el calibre de la aguja utilizada (usualmente 26-30) 5,25,26 deben ser elegidos con base en el tamaño de las células de modo que el diámetro interno de la aguja es lo suficientemente grande para evitar Sheering. Para evitar confunde debido a procesos inflamatorios provocados por la cirugía, algunos investigadores han reportado con una trampa que se manipula ex vivo para ocluir y reperfundir el corazón de un ratón de tórax cerrado en cualquier momento después de la cirugía 27-29. Más recientemente, Gao et al. 30 han demostrado que la oclusión temporal y permanente se puede realizar sin la necesidad de ventilación y algunos laboratorios han empezado a utilizar el ultrasonido para llevar a cabo a tórax cerrado intramiocárdica inyecciones 25,31.

Desde el primer estudio que demuestra la viabilidad de la ligadura de la arteria coronaria en ratones fue publicado por Johns y Olson en 1954, de 32 años, muchos otros han adoptado este modelo y lo modificó para estudiar diversos aspectos de la lesión miocárdica y remodelación 3,33-45. La naturaleza de los ratones en términos de tamaño, capacidad de reproducción, y el costo relativamente menor para la compra y mantenimiento hacen que esta especie en una herramienta atractiva para una amplia gama de estudios fisiológicos y fisiopatológicos. A medida que la miniaturización de la tecnología para obtener imágenes de los avances en vivo 46-49, así como los medios para llevar a cabo y analizar la genómica y la proteómica a gran escala, la detección de drogas, la eficacia de las terapias basadas en células y / o proteínas, así como biomateriales 50-64, en combinación con el número cada vez mayor de las manipulaciones genéticas ofrecidas por todas partes o tejidos específicos de los ratones transgénicos o mutantes / octavos de final, el modelo murino de infarto de miocardio, sin duda, seguirá siendo una herramienta muy valiosa en la evaluación del daño cardíaco agudo y la remodelación a largo plazo. Por lo tanto, no es un valor incuestionable en el poder para llevar a cabo estos experimentos de forma fiable y reproducible.

Divulgaciones

Este protocolo fue aprobado por los animales y está en conformidad con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la East Carolina University.

Agradecimientos

Me gustaría agradecer al Departamento de Investigación y Estudios de Posgrado para la provisión de fondos para apoyar mi investigación y el Departamento de Medicina Comparada de la vigilancia y asistencia. También me gustaría reconocer el Departamento de Fisiología por su apoyo y orientación, así como los estudiantes y técnicos en mi laboratorio por su ayuda. Por último, me gustaría agradecer a mi post-doctoral mentor, el Dr. Charles E. Murry, de la oportunidad de estudiar durante ese tiempo me enteré de la microcirugía del ratón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tijeras largas de VannaGeorge Tiemann & Co.160-159
Tijeras microquirúrgicasGeorge Tiemann & Co.160-161
Pinzas – rectas, con 1x2 dientesGeorge Tiemann & Co.105-205
Manija de bisturí n.º 3George Tiemann & Co.105-64Hoja estéril n.º 10
Pinzas – curvas medianas, con estríasGeorge Tiemann & Co.160-19
Tijeras para tejidosGeorge Tiemann & Co.105-410
Portaagujas CastroviejoMiltex Inc.18-1828
Espéculo ocular CookMiltex Inc.18-63
Surgipro II 8-0Suture ExpressVP-900-X
Prolene 6-0Suture Express8776
Esterilizador de perlas Germinator 500Cellpoint Scientific65369-1
Almohadilla isotérmica DeltaphaseBraintree Scientific, Inc.39DP
Jeringa Hamilton - 25μlHamilton Co80430
Aguja biselada de calibre 30Hamilton Co7803-07
VentiladorKent ScientificTOPO

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