$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Punción en el dedo de muestra de sangre
- Recolección de sangre entera se toma típicamente en reposo por una medida de referencia (normalmente después de 10-15 minutos de descanso sentado), durante o inmediatamente después de una sesión de ejercicio, y durante todo el período post-ejercicio (por lo general a partir de 1-3 horas tras el cese de la ejercicio).
- Utilizando las precauciones universales, en primer lugar esterilizar la yema del dedo con el 70% de alcohol isopropílico.
- Punción A continuación, el sitio usando una lanceta automatizado o dispositivo similar. A pesar de que el uso de una lanceta de calibre 30 para proporcionar la comodidad tema, una aguja de calibre grande podrían ser utilizados.
- Limpie la primera gota de sangre, y luego recoger la sangre en tubos capilares o microvettes tratados con heparina de litio para evitar la coagulación.
2. Fenotipo celular y la apoptosis de tinción
- Añadir 10 l de sangre entera heparinizada al panel de anticuerpos tituló en 250 l de tampón de unión (véase el cuadro 1 esquema). Hemos utilizado un factor de dilución 1:20 con éxito, pero cada laboratorio debe su título de reactivos para determinar la mejor solución de trabajo.
Tabla 1. Anticuerpos del panel para la determinación de la apoptosis inducida por el ejercicio en subconjuntos de leucocitos. Principios de la apoptosis se define por la expresión de anexina V, mientras que la apoptosis tarde fue definida por el doble etiquetado positivo con anexina V y 7-AAD. Las células necróticas se anexina V y 7-AAD + sólo las células.
| Un tubo | Tubo 2 | Tubo 3 | Tubo de 4 |
| Las únicas células del tubo | Anexina V - FITC | Anexina V - FITC | Anexina V - FITC |
| Contra CD4 Humanos - PE | Anti-CD8 Humanos - PE | Contra CD19 humano - PE |
| 7-AAD | 7-AAD | 7-AAD |
| Humanos contra CD45RA - APC | Humanos contra CD45RA - APC | |
7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = aloficocianina, CD4 = linfocitos T, CD8 = supresor / linfocitos T citotóxicos, CD19 = linfocitos B, CD45RA = subconjuntos de células ingenuas, FITC = isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina = PE. - Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
- Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos.
- Se decanta, añadir 300 l Glóbulos Rojos tampón de lisis, y completamente vórtice.
- Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Añadir 300 l de PBS para detener la reacción RBC lisis.
- Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos.
- Se decanta, rack, y se añaden 50 l de tampón de unión.
- Analizar por citometría de flujo.
Se recomienda que, como mínimo, los siguientes controles se utilizaron: un tubo de células sólo para servir como un control negativo en la detección de autofluorescencia de fondo, y tubos que contienen cada uno fluorocromo para ajustar la compensación de la preparación inicial del citómetro de flujo. Además, se han utilizado cuentas de compensación estándar con éxito para crear nuestros experimentos.