Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Resumen

Este es un protocolo para preparar y mantener una rebanada preparación neocortical en la cultura organotípicos con el propósito de realizar grabaciones eléctricas de las neuronas piramidales.

Resumen

Hemos estado estudiando el papel funcional de expresión y de voltaje canales de potasio en las neuronas piramidales de la corteza cerebral de rata. Debido a la falta de agentes farmacológicos específicos para estos canales, hemos tomado un enfoque genético para la manipulación de la expresión del canal. Utilizamos una preparación cultivo organotípico (16) con el fin de mantener la morfología celular y el patrón laminar de la corteza. Por lo general aislar aguda rebanadas neocortical en 8-10 días después del parto y mantener los cortes en la cultura durante 3-7 días. Esto nos permite estudiar las neuronas a una edad similar a los de nuestro trabajo con las rebanadas de agudos y reduce al mínimo el desarrollo de una exuberante conexiones excitadoras en el corte. Grabamos de forma visual se identifican las neuronas piramidales en las capas II / III o V con iluminación por infrarrojos (IR) y microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) con pinza de toda mancha de células en la corriente o voltaje-clamp. Usamos biolística (pistola de genes) de la transfección de tipo salvaje o mutante de ADN del canal de potasio para manipular la expresión de los canales para estudiar su función. Las células transfectadas son fácilmente identificables por microscopía de epifluorescencia después de co-transfección con ADNc para la proteína verde fluorescente (GFP). Se comparan las grabaciones de las células transfectadas con las neuronas adyacentes, untransfected en la misma capa de la misma división.

Protocolo

1. Preparativos antes del Día de rebanar

Encontramos que es más eficiente para autoclave de los instrumentos quirúrgicos y de preparar las soluciones antes de la fecha de corte.

1. Autoclave de los instrumentos. (La cirugía y el corte se realiza bajo condiciones de semi-estériles). Autoclave de los siguientes paquetes, envueltos individualmente en papel de autoclave:
   • Paquete de la cirugía: espátula, # 22 mango bisturí, tijeras, pinzas
   • Paquete de corte de 3 botones (hoja de retención de mando y dos botones de sujeción de baño) y de protección de disco (tiene una hoja....

Discusión

Hemos estado estudiando el papel funcional de expresión y de voltaje canales de potasio en las neuronas piramidales de la corteza cerebral de rata (4, 9-11). Debido a la falta de agentes farmacológicos específicos para estos canales, se utiliza un enfoque genético para la manipulación de la expresión del canal (1,14,15,17-19). Utilizamos una preparación de la cultura organotípicos (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificada del enfoque de Stoppini et al (16), a fin de mantener la morfología celular y el patrón.......

Materiales

Cirugía / transfección / cultura:

1. Cerebro Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Instrumentos de Precisión Mundial, Sarasota, FL, EE.UU.
2. Sistema Gene Gun: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
   • Incluye: pistola de genes, manguera de helio con el regulador, la tubería de preparación de trenes (# 165 a 2.418), kit de jeringa, tubo de Tefzel, cortador de tubo, kit de optimización (# 165 hasta 2424), cortador de tubo
   • Bio-Rad Helio Regulador (# 165-2413)
   • materiales desechables de Helios de Bio-Rad:
     • 1,6 micras de oro microportadores: # 165-2264
     • Tubos Tefzel: # 165-2441
3. Incubadora: Forma Scientific modelo # 3110 (Thermo-Científico: (866) 984 hasta 3766).

Los medios de comunicación:

1. Suero de caballo: Hyclone donantes equina # 30074 SH. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
2. HMEM (medio mínimo esencial, más HBSS y HEPES, no glutamina: Lonza BioWhittaker Catálogo # 12-137f): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 a 6288, Opción 1.
3. HBSS (GIBCO Hanks solución salina tamponada, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 a 6288, Opción 1.
4. MEM (GIBCO medio esencial mínimo, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955 a 6288, Opción 1.
5. 250 ml Millipore 0,2 micras filtro: # SC6PU02RE
6. Pipetas de plástico de transferencia: Fisher # 13-711-20.
7. 50 ml Millipore 0,22 micras steriflip filtro (# SCGP00525)

Artículos 8.6, diríjase a: Fisher Scientific, 1241 Blvd. Embajador, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Grabación:

1. Pipeta de vidrio: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 octubre Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
2. Sutter P-87 extractor de electrodos horizontales: Empresa Sutter instrumento, una unidad digital, Novato, CA 94949
3. Axon Instruments MultiClamp 700B amplificador: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
4. PCLAMP 10 software de adquisición de datos: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
5. lectrode posición se controla con Sutter ROE-200 manipuladores y PC-200: Sutter Instrument Company, una unidad digital, Novato, CA 94949.
6. Microscopio: Olympus BX-50WI microscopio vertical con IR-DIC óptica
7. IR-sensibles cámara OLY-150 (Olympus) o DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 Norte Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).