La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Resumen

Se describe un inmunoensayo simple para medir la producción de citoquinas pro-inflamatorias, como IL-1 beta, en pacientes con fenotipos autoinflamatoria. Mediante la activación de las células en cultivos de sangre total con el patógeno patrones moleculares asociados, específicamente con lipopolisacárido, la secreción de citoquinas puede ser convenientemente evaluada en los sobrenadantes de sangre total.

Resumen

Los procesos inflamatorios como resultado de la secreción de mediadores solubles de las células inmunes, conducen a diversas manifestaciones en la piel, articulaciones y otros tejidos, así como la homeostasis alterada de citoquinas. El sistema inmune innato desempeña un papel crucial en el reconocimiento de patógenos y otros estímulos endógenos peligro. Una de las principales citoquinas liberadas por células del sistema inmune innato es interleuquina (IL) -1. Por lo tanto, utilizamos un análisis de sangre toda la estimulación con el fin de medir la secreción de citoquinas inflamatorias y, específicamente, de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β ^{1, 2, 3.}

Los pacientes con trastornos genéticos del sistema inmune innato que causan síndromes de autoinflamatoria muestran una versión exagerada de IL-1β madura a la estimulación con LPS solo. Con el fin de evaluar el componente inmune innato de los pacientes que presentan patologías inflamatorias asociadas, se utiliza un inmunoensayo específico para detectar la respuesta inmune celular a patógenos patrones moleculares asociados (PAMP), tales como las endotoxinas bacterianas gram-negativas, el lipopolisacárido (LPS ). Estos PAMPs son reconocidos por receptores de reconocimiento de patógenos (RRP), que se encuentran en las células del sistema inmune innato ^{4, 5, 6, 7.} Una señal de primaria, LPS, junto con una señal secundaria, ATP, es necesaria para la activación de la inflamasoma, un complejo multiproteico que los procesos de pro-IL-1β a su forma madura, bioactivos ^{4, 5, 6, 8, 9, 10.}

La prueba de sangre entera requiere una manipulación mínima de la muestra para evaluar la producción de citoquinas en comparación con otros métodos que requieren mucha mano de obra de aislamiento y cultivo de poblaciones celulares específicas. Este método se diferencia de otras pruebas de sangre entera estimulación, en lugar de diluir las muestras con una proporción de RPMI medios de comunicación, se realiza un recuento de glóbulos blancos directamente de la sangre entera diluida y, por tanto, estimular un número conocido de células blancas de la sangre en la cultura ^2. Los resultados de este ensayo en sangre entera en particular demostrar una nueva técnica útil en el esclarecimiento de cohortes de pacientes que presentan fisiopatologías autoinflamatoria.

Protocolo

1. Recolección de sangre entera

1. Obtener un mínimo de 10 ml de sangre periférica de los individuos afectados, así como la edad y el sexo controles sanos. La sangre venosa se deberían recoger en tubos vacutainer con heparina sódica de recolección de sangre, en lugar de utilizar otros anticoagulantes como EDTA, y se invierte varias veces para asegurar una mezcla adecuada con la heparina sódica. Tenga en cuenta que 10 ml es el volumen mínimo de sangre requerido para la siembra en las muestras por duplicado para este ensayo en particular.
2. Las muestras deben ser procesadas tan pronto como sea posible después de la recolección para obtener mejores resul....

Discusión

La prueba de sangre entera se describe un método simple que reproduce mejor las condiciones fisiológicas en comparación con otras técnicas que requieren aislamiento de células y procesamiento de muestras extensas y la manipulación. Este método utiliza la visión Cellometer con AO para contar los glóbulos blancos en la sangre y por lo tanto, proporciona una manera de estandarizar la precisión muestras basadas en el número de células.

Hay que tener en cuenta que para este ensayo, la sangre ente.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de recolección de sangre con heparina sódica	BD Biosciences	366480
Medio RPMI 1640	GIBCO, por Life Technologies	21870-100
Acridina naranja	Invitrogen	A3568
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience		Comuníquese con la empresa para obtener información sobre el instrumento
Cámaras de recuento de células Cellometer	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
Placa de cultivo celular de 24 pocillos	Corning	3524
LPS de E. coli K12 ultrapuro	Invitrogen	tlrl-eklps
Adenosina 5´-trifosfato, sal disódica hidratada	Sigma-Aldrich	A26209
Sistema Bio-plex 200	Bio-Rad		Comuníquese con la empresa para obtener información sobre el instrumento
Ensayo x-plex Bio-Plex Pro para citocinas humanas	Bio-Rad		Los ensayos x-plex se fabrican a medida según las citocinas de interés especificadas