Se demuestra una In vivo Electroporación protocolo para la transfección de grupos individuales o pequeños grupos de células ganglionares de la retina (CGR) y otros tipos de células de la retina en ratones postnatales en un amplio rango de edades. La capacidad de etiquetar y manipular genéticamente CGR postnatal In vivo Es una poderosa herramienta para los estudios de desarrollo.
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Artículo de método
La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación
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Resumen
Resumen
La selección y el refinamiento de las proyecciones de RGC para el cerebro medio es un sistema modelo popular y de gran alcance para el estudio de cómo los patrones precisos de la forma de conectividad neuronal durante el desarrollo. En los ratones, las proyecciones retinofugal están dispuestos de una manera topográfica y la forma del ojo específicos de las capas del núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo y el colículo superior (SC). El desarrollo de estos patrones precisos de proyecciones retinofugal típicamente ha sido estudiado por el etiquetado las poblaciones de la CGR con tintes fluorescentes y marcadores, como la peroxidasa de rábano picante 1-4. Sin embargo, estos métodos son demasiado gruesas para dar una idea de los cambios de desarrollo en cada morfología axonal RGC cenador que son la base de la formación del mapa retinotópica. Asimismo, no permitir la manipulación genética de la CGR.
Recientemente, la electroporación se ha convertido en un método eficaz para proporcionar un control preciso espacial y temporal para la entrega de las moléculas cargadas en la retina 05.11. Los protocolos actuales de electroporación retina no permiten la manipulación genética y la localización de las proyecciones de retinofugal de un solo grupo o pequeño de la CGR en ratones postnatales. Se ha argumentado que después del parto en la electroporación in vivo no es un método viable para la transfección CGR desde el etiquetado de eficiencia es muy baja y por lo tanto requiere dirigidos a edades embrionarias cuando los progenitores RGC están experimentando la diferenciación y la proliferación de 6.
En este video se describe un protocolo de electroporación in vivo para la entrega selectiva de genes, shRNA, y dextranos fluorescentes para CGR murino después del nacimiento. Esta técnica proporciona una solución eficaz, rápida y relativamente fácil de plataforma para la detección eficaz de los genes candidatos involucrados en varios aspectos del desarrollo neural como la retracción del axón, la ramificación, la laminación, la regeneración y la formación de sinapsis en las distintas etapas del desarrollo del circuito. En resumen, como se describe aquí una valiosa herramienta que ofrecerá nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo del mapa sensorial.
Protocolo
1. Instalación del equipo de electroporación
- Electrodos: Hemos modificado Dumont # 5 pinzas para su uso como electrodos.
- Separado y se separan las pinzas.
- Soldar un cable en el extremo más ancho de cada diente. Envuelva el cable conectado y puntas con cinta aislante dejando aproximadamente 25-30 mm de la punta de los dientes expuestos.
- Ponga las pinzas modificado de nuevo junto con los espaciadores plásticos adecuados (por ejemplo un botón) entre las dos puntas para proporcionar una acción de resorte.
- Equipo eléctrico: Utilizamos un estimulador eléctrico para entregar pulsos de corriente de....
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Discusión
En este video se demuestra un protocolo de electroporación in vivo que se traduce en el etiquetado de los grupos individuales o pequeños de las neuronas de la retina en ratones postnatales, con construcciones de ADN que codifican las proteínas fluorescentes. Pequeños grupos de marcado con fluorescencia proyecciones CGR a la dLGN SC y reproduce patrones similares de proyección ya que estudios previos con el etiquetado de CGR con colorantes lipofílicos, lo que indica que la electroporación no interferir .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
El plásmido pCAG-gapEGFP fue un regalo del doctor S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plásmido fue un regalo del doctor Feller M. (Berkeley, CA). Agradecemos al Dr. Edward Ruthazer por sugerir el uso de una estrategia de dos plásmidos para el etiquetado de células individuales y Schohl Anne (Montreal, QC) para validar los dos plásmidos Cre / loxP estrategia en los estudios piloto y los miembros de Crair de laboratorio para soporte técnico. Con el apoyo de R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) y NIH P30 EY000785 (MC).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales | Empresa | Número de catálogo | |
| Dumont # 5 Pinzas | Herramientas de Bellas Ciencia | 11252-20 | |
| Estimulador eléctrico | Grass Instruments | Modelo S4 | |
| Osciloscopio | Agilent | Modelo 54621A | |
| Monitor de audio | Grass Instruments | Modelo AM8B | |
| Extractor | Sutter Instrumentos | Modelo P-97 | |
| Vannas Tijeras una | Mundial de Instrumentos de Precisión | 14003 | |
| Micro Tijeras b | Ted Pella | 1347 | |
| Dumont AA Pinzas c | Herramientas de Bellas Ciencia | 11210-20 | |
| Nanoinject II del Sistema | Drummond Científico | 3-000-204 | |
| Pipetas de vidrio | Drummond Científico | 3-000-203-G / X | |
| Pedal | Drummond Científico | 3-000-026 | |
| Aceite mineral | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DII | Invitrogen | D-383 | |
| N, N-dimetilformamida | Sigma | D4551 |
Referencias
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement....
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Reimpresiones y permisos
