Un nuevo método para la encapsulación de los folículos ováricos en 3D de fibrina-alginato red interpenetrante se describe. Este sistema combina un soporte estructural a la degradación proteolítica de apoyar el desarrollo de folículos inmaduros para producir ovocitos maduros. Este método puede ser aplicado a los agregados de cultivo celular para mantener contactos célula-célula, sin limitar la expansión.
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Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema
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Resumen
Resumen
El folículo ovárico es la unidad funcional del ovario que segrega las hormonas sexuales y apoya la maduración de ovocitos. En las técnicas in vitro de folículos proporcionar una herramienta para el desarrollo del folículo modelo para investigar la biología básica, y además se está desarrollando como una técnica para preservar la fertilidad en el clínica 1-4. Nuestro sistema de cultivo in vitro cuenta con hidrogeles con el fin de imitar el ambiente de ovario nativos mediante el mantenimiento de la arquitectura folicular en 3D, interacciones célula-célula y la señalización paracrina que el desarrollo del folículo directa 5. Anteriormente, los folículos se cultivaron con éxito en alginato, un derivado de algas inertes polisacárido que se somete a la gelificación de los iones de calcio 6-8. Hidrogeles de alginato forma a una concentración de 0,25% w / v fueron las más permisivas de la cultura del folículo, y mantiene la más alta competencia en el desarrollo 9. Hidrogeles de alginato no son degradables, por lo tanto un aumento en los resultados de folículos de diámetro en una fuerza de compresión en el folículo que pueden afectar el crecimiento del folículo 10. Hemos desarrollado posteriormente un sistema de cultivo basado en una red de fibrina, alginato de interpenetración (FA-IPN), en el que se gelifican una mezcla de fibrina y alginato de forma simultánea. Esta combinación proporciona un entorno dinámico mecánico debido a que ambos componentes contribuyen a la rigidez de la matriz inicial, sin embargo, las proteasas secretado por el folículo creciente degradación de fibrina en la matriz de alginato dejando sólo para brindar apoyo. Con el IPN, el contenido de alginato se puede reducir por debajo del 0,25%, lo que no es posible con alginato solo 5. Por lo tanto, cuando el folículo se expande, se experimentará una fuerza de compresión reducida debido a la reducida contenido de sólidos. En este documento, se describe un método de encapsulación y un sistema de cultivo in vitro de los folículos ováricos en un FA-IPN. El entorno mecánico dinámico simula el entorno del ovario natural en el que residen los pequeños folículos en la corteza rígida y pasar a una médula más permisiva, ya que aumentan de tamaño 11. El componente degradable puede ser particularmente importante para la traducción clínica con el fin de apoyar el mayor de 10 en 6 veces el aumento en el volumen que los folículos humanos normalmente pasan en vivo.
Protocolo
1. Folículo de aislamiento
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por los Institutos Nacionales de la Salud Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el uso establecido de Animales institucional y el protocolo de atención de la Northwestern University.
Para mejores resultados, todas las disecciones se llevan a cabo en los medios de comunicación L15 para controlar el pH en los niveles ambientales de CO 2, en 37 ° C se calienta etapas para el control de la temperatura, y sobre un banco limpio para reducir al mínimo la contaminación ....
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Discusión
El folículo ovárico presenta un método de encapsulación en FA-IPN permite cultivo de folículos en un entorno 3D in vitro. A FA-IPN es un proceso dinámico, de células sensibles a la matriz en la que las propiedades mecánicas iniciales están determinadas por la combinación de ambos fibrina y alginato. Durante el cultivo, el folículo encapsulado activa proteasas que degradan el único componente de la IPN, la fibrina, que se traduce en una rigidez gel disminuyendo gradualmente que es aportado exclusivamente por el .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el NIH (U54HD41857 y PL1EB008542, un procesador Core P30 Biomateriales en el Consorcio Oncofertility conceder Hoja de Ruta).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fetuína | Sigma-Aldrich | F3385 | |
| SFB | Invitrogen | 10082-139 | |
| Aprotinina | Roche Group | 10236624001 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00475 | 40 mM |
| EGF | Sigma-Aldrich | A412 | |
| rFSH | Instituto Nacional de la Diabetes y las Enfermedades Digestivas y Renales | ||
| hCG | Sigma-Aldrich | CG-5 | |
| Hialuronidasa | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I1884-1VL | |
| L-15 | GIBCO, por Life Technologies | 11415 | |
| αMEM+Gluta MAX | GIBCO, por Life Technologies | 32561 | |
| Pen-Estrepto | Cellgro | 30-002-CI | |
| TBS | Pierce, Thermo Scientific | 28379 | |
| Kit de fibrina Tisseel | Baxter Internationl Inc. | 921030 | |
| Alginato de sodio | FMC BioPolymers | LF200DL | Mw 418kDa |
Referencias
- Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).
- Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X.
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Reimpresiones y permisos
