Inmunofluorescencia ensayo de leptospiras superficie expuesta proteínas

Resumen

Un método eficaz para evaluar la superficie de exposición de las proteínas de la leptospirosis se describe. El método está diseñado específicamente para evitar la interrupción de la frágil membrana externa de las células de leptospira. Esta técnica requiere el empleo de varios controles negativos para evaluar la integridad de la membrana externa y la especificidad de la reacción de los anticuerpos.

Resumen

La superficie de las proteínas bacterianas están involucradas en contacto directo con las células huésped y en la absorción de nutrientes del medio ambiente ^1. Por esta razón, la localización celular puede ayudar a comprender el papel funcional de las proteínas bacterianas. Localización de la superficie de las proteínas bacterianas es un paso clave hacia la identificación de factores de virulencia que participan en los mecanismos de patogenicidad.

Métodos de fraccionamiento ^2.5 membranas leptospira puede ser selectiva para una cierta clase de proteínas de la membrana externa (OMP), como las lipoproteínas vs OMPs transmembrana, y por lo tanto, llevar a errores de clasificación. Esto probablemente es debido a las diferencias estructurales y la forma en que están asociados a la membrana externa. Las lipoproteínas se asocia con membranas a través de una interacción hidrofóbica entre la fracción lipídica N-terminal (tres ácidos grasos) y los fosfolípidos bicapa lipídica ^{6, 7.} Por el contrario, OMPs transmembrana suelen estar integrados en la bicapa lipídica por anfipáticas β-hojas dispuestas en una estructura de barril-como ^{8, 9.} Además, la presencia de una proteína en la membrana externa, no garantiza necesariamente que la proteína o sus dominios están expuestos en la superficie. Espiroquetas membranas externas se sabe que son métodos frágil y por tanto, requiere la participación manipulación suave de las células y la inclusión de proteínas de sub-superficie de control para evaluar la integridad de la membrana externa.

A continuación, presentamos un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) para evaluar directamente la exposición de la superficie de las proteínas en las leptospiras intacto. Este método se basa en el reconocimiento de proteínas de la superficie de leptospiras por el antígeno de anticuerpos específicos. En esto, los anticuerpos específicos para OmpL54 ¹⁰ son detetcted aftero vinculante a los nativos epítopos de la superficie, expuestos. Comparación de la reactividad de anticuerpos frente a células intactas permeabilized permite la evaluación de la distribución de celulares y si una proteína está presente en la superficie de forma selectiva leptospirosis. La integridad de la membrana externa deben ser evaluados utilizando anticuerpos contra una o más proteínas del subsuelo, preferentemente en el periplasma.

El método de la superficie de la IFA se puede utilizar para analizar la exposición de la superficie de cualquier proteína de leptospira a que los anticuerpos específicos disponibles. Tanto la utilidad y las limitaciones del método depende de si los anticuerpos empleados son capaces de unirse a epítopos nativos. Dado que los anticuerpos a menudo se levantan contra las proteínas recombinantes, los epítopos de los nativos, expuestas en la superficie las proteínas no pueden ser reconocidos. Sin embargo, el método de la superficie de IFA es una herramienta valiosa para el estudio de los componentes de la superficie bacteriana intacta. Este método se puede aplicar no sólo para las leptospiras, pero también otras espiroquetas y bacterias gram-negativas. Para conclusiones más sólidas sobre la superficie de exposición de OMP, un enfoque integral que implique a varios métodos de localización celular se recomienda ^10.

Protocolo

1. La fijación de Leptospira a las diapositivas de cristal

1. Leptospira interrogans es una clase BSL2 patógeno. Trabajar con células vivas que requiere un manejo adecuado, como guantes, bata de laboratorio y medidas de pipeteo en una campana estéril.
2. Crecer Leptospira en EMJH medium11, complementada con suero de conejo al 1% a 30 ° C hasta llegar a mediados o finales de la fase de inicio de sesión (la densidad de 5 x 10 ⁷ 5 x 10 ⁸ células / ml) durante aproximadamente 6 días.
3. La cosecha del cultivo por centrifugación a 2000 xg durante ~ 7 minutos a temperatura ambiente.
4. Eliminar el sobrenadante por....

Discusión

La superficie de nuestra técnica de IFA es similar a la utilizada para demostrar la superficie de exposición de los diversos borrelial ^{15, 16} y leptospirosis ^{12, 17} proteínas. Los detalles de la superficie, método IFA descritos aquí están diseñados para reducir al mínimo la manipulación de células en un esfuerzo por mantener la integridad de la membrana externa de tiempo que se aprovechan de la tendencia de las células de Leptospira a adherirse a las diapositivas de cristal. El método consiste en u.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Dos, así la cámara de diapositivas de vidrio	Lab-Tek	177380
Suero de conejo	Rockland inmunoquímicos	D209-00-0100
Leptospira enriquecimiento EMJH	BD Difco	279510
Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG (H + L)	Invitrogen / sondas moleculares	A-11034
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (H + L)	Invitrogen / sondas moleculares	A-11029
4'6-diamidino-2-fenil-indol dihidrocloruro (DAPI)	Invitrogen / sondas moleculares	D1306
Prolongar Oro anti-fade medio de montaje	Invitrogen / sondas moleculares	P36930	Alcancen la temperatura ambiente antes de su uso
Fisherfinest prima de vidrio cubierta	Pescador	12-544-14
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Axioskop 40