Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

Resumen

Un método de citometría de flujo para la identificación y el análisis molecular de la diferenciación de etapas específicas de murino progenitores eritroides y precursores, directamente en la médula ósea recién cosechadas del ratón, el bazo o el hígado fetal. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119 y tamaño de la celda.

Resumen

El estudio de la eritropoyesis tiene como objetivo entender cómo las células rojas se forman a partir de progenitores hematopoyéticos y antes eritroides. En concreto, la tasa de formación de glóbulos rojos está regulada por la hormona eritropoyetina (EPO), cuya síntesis es provocada por la hipoxia tisular. Una amenaza para la adecuada oxigenación a los tejidos en los resultados de un rápido aumento de la EPO, impulsando un aumento en la tasa de eritropoyesis, un proceso conocido como la respuesta al estrés eritropoyética. El aumento resultante en el número de glóbulos rojos mejora la entrega de oxígeno tisular. Una respuesta eficaz estrés eritropoyética tanto, es fundamental para la supervivencia y la recuperación de las condiciones fisiológicas y patológicas como la altitud, anemia, hemorragia, la quimioterapia o trasplante de células madre.

El ratón es un modelo clave para el estudio de la eritropoyesis y su respuesta al estrés. Eritropoyesis definitiva del ratón (tipo adulto) se lleva a cabo en el hígado fetal entre los días embrionarias 12,5 y 15,5, en el bazo neonatal, y en el bazo y la médula ósea adulta. Los métodos clásicos de identificación de los progenitores eritroides en el tejido de confiar en la capacidad de estas células para dar lugar a colonias de glóbulos rojos cuando se siembran en la EPO que contienen medio semi-sólido. Su progenie precursores eritroides se identifican con base en criterios morfológicos. Ninguno de estos métodos clásicos permiten el acceso a un gran número de diferenciación de etapas específicas de las células eritroides para el estudio molecular. Aquí presentamos un método de citometría de flujo de identificación y estudio de la diferenciación etapa específica de los progenitores eritroides y precursores, directamente en el contexto de tejido de ratón recién aisladas. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119, y en la citometría de flujo parámetro "dispersión frontal, que es una función del tamaño de la celda. El ensayo CD71/Ter119 puede ser usado para estudiar los progenitores eritroides en su respuesta al estrés eritropoyética en vivo, por ejemplo, en ratones con anemia o ratones alojados en condiciones de poco oxígeno. También puede ser utilizado para estudiar los progenitores eritroides directamente en los tejidos de ratones adultos o de embriones genéticamente modificados, a fin de evaluar la función específica de la vía de modificación molecular de la eritropoyesis.

Protocolo

1. La recolección de los tejidos

1. Prepare los tubos que contienen 2 a 5 ml de tampón de tinción de frío (tampón fosfato salino (PBS) con adición de 0,2% de BSA y glucosa 5 mM). Mantenga los tubos en hielo antes de la cosecha de tejidos.
2. Ratones sacrificio acuerdo con el protocolo adecuado aprobado (por ejemplo, CO ₂ por inhalación seguido por dislocación cervical).
3. Extracción de sangre por punción cardiaca en tubos con EDTA o heparina de recogida de sangre para su posterior análisis, por ejemplo, de hematocrito, recuento de reticulocitos o análisis CBC.
4. Cosecha el bazo y los huesos, la colocación de los tejidos de ca....

Discusión

La metodología de citometría de flujo permite la investigación simultánea de cualquier función celular que puede ser detectada con un anticuerpo específico conjugado con fluorescencia o ligando, incluidos los marcadores de superficie celular, expresión de la proteína, la supervivencia celular, la señalización celular utilizando fosfato anticuerpos específicos ³ y el estado del ciclo celular. Estas mediciones se pueden hacer en cada uno de una serie de subgrupos específicos de la etapa de diferenciación, en el.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Fas-biotina	BD Pharmingen	554256
Estreptavidina-APC	Las sondas moleculares	S868
40 micras filtro de células estériles	Fisherbrand	22363547
Poliestireno de fondo redondo de tubos para la tinción FACS	BD Falcon	352008
De fondo en U placa de 96 pocillos	BD Falcon	353910
ChromePure conejo IgG	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
CD71-FITC (stock 0.5mg/ml)	BD Biosciences-	553266
Ter119-PE (stock 0.2mg/ml)	BD Biosciences-	553673
7AAD	BD Biosciences-	559925
DAPI en polvo	Roche	236276
FITC rata anti-CD41 de ratón MWReg30	BD Pharmingen	553848
FITC rata anti-ratón CD45R/B220 RA3-6B2	BD Pharmingen	553087
FITC rata anti-ratón CD411b/Mac-1 M1/70	BD Pharmingen	557396
Rata FITC anti-ratón Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD Pharmingen	553126
Hamster FITC anti-ratón CD3e 145-2C11	BD Pharmingen	553061
APC BrdU flujo kit	BD Pharmingen	557892
Anexina V-biotina	BD Pharmingen	556418