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Artículo de método

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

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DOI:

10.3791/2813

⸱

16 de julio de 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

Un Ex vivo Protocolo para generar células maduras de la sangre humana rojo de madre hematopoyéticas / progenitores se describe. Además se describe una eficiente entrega lentiviral método para derribar el TAL1 factor de transcripción en las células eritroides primaria. La eficiencia de la administración de genes mediada por lentivirus se demuestra el uso de virus que expresan GFP.

Resumen

La eritropoyesis es un sistema modelo utilizado para estudiar la diferenciación celular. Durante la eritropoyesis, pluripotentes humanas adultas células madre hematopoyéticas (HSC) se diferencian en células progenitoras oligopotent, precursores comprometidos y los glóbulos rojos maduros 1. Este proceso está regulado en gran parte a nivel de la expresión génica, en el que factores de transcripción específicos del linaje activar genes específicos, mientras que simultáneamente la represión de los genes que son específicos para otros tipos de células 2. Los estudios sobre factores de transcripción que regula la eritropoyesis se realizan a menudo con líneas celulares humanas y murinas que representan, en cierta medida, las células eritroides en las etapas de diferenciación dado 5.3. Sin embargo, líneas de células transformadas pueden imitar sólo parcialmente las células eritroides y lo más importante no permitir que un estudio de forma comprensible los cambios dinámicos que ocurren cuando las células de los avances a través de muchas etapas hacia su último destino eritroides. Por lo tanto, un reto actual sigue siendo el desarrollo de un protocolo para obtener una población relativamente homogénea de las CMH primario y las células eritroides en las diversas etapas de diferenciación en cantidades que sean suficientes para llevar a cabo la genómica y la proteómica experimentos.

A continuación se describe una célula de ex vivo protocolo de cultivo para inducir la diferenciación eritroide de hematopoyéticas humanas células madre / progenitoras que han sido aislados de sangre del cordón umbilical o de médula ósea o sangre periférica movilizada para adultos con G-CSF (aféresis). Este sistema de cultivo, inicialmente desarrollado por el laboratorio de Douay 6, utiliza las citocinas y la cultura co-en las células mesenquimales para imitar el microambiente de la médula ósea. El uso de este protocolo de diferenciación in vivo ex, se observa una fuerte amplificación de los progenitores eritroides, la inducción de diferenciación exclusivamente hacia el linaje eritroide y una maduración completa a la etapa de enucleado los glóbulos rojos. Así, este sistema ofrece la oportunidad de estudiar el mecanismo molecular de la regulación transcripcional de las células madre hematopoyéticas progreso a lo largo del linaje eritroide.

El estudio de la eritropoyesis en el nivel de la transcripción también se requiere la capacidad de los factores específicos de más de expresar o una caída en la enseñanza primaria las células eritroides. Para ello, se utiliza un sistema de genes lentivirus mediada por la entrega que permite que la infección eficiente de la división y que no se dividen las células 7. Aquí mostramos que somos capaces de caída de manera eficiente la TAL1 factor de transcripción en células primarias de eritroides humanos. Además, la expresión de GFP demuestra una eficiencia de la infección por lentivirus cerca del 90%. Por lo tanto, el protocolo ofrece un sistema muy útil para la caracterización de la red de regulación de factores de transcripción que la eritropoyesis control.

Protocolo

Parte I. Eritropoyesis ex vivo de células madre/progenitoras hematopoyéticas humanas

1. Aislamiento de células madre/progenitoras hematopoyéticas humanas CD34+

La población de células CD34+ humanas, que contiene una mezcla de células madre hematopoyéticas (CMH) y precursores tempranos8, se obtiene de sangre de cordón umbilical, sangre periférica movilizada con G-CSF (leucoaféresis) o médula ósea (Figura 1-Paso 1). Si se utiliza sangre de cordón o sangre periférica, pase directamente al paso 1.2. Si se utiliza médula ósea, comience en el paso 1.1. Para reactivos y equipo, consulte la Tabla 1.

Este paso se realiza en condiciones estériles (es decir, en cabina) y a temperatura ambiente (RT), salvo que se indique lo contrario.

  1. Preparar una suspensión de células individuales de médula ósea:
    1. Re-suspender la médula en 10 volúmenes de RPMI 1640 que contenga 0,02 % de colagenasa B y 100 U/ml de DNasa 1
    2. Mezclar suavemente en un agitador de balanceo durante 45 min.
    3. Filtrar las células a través de una malla de nailon de 30 μm.
  2. Aislar las células mononucleares (MNC) de baja densidad mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll:
    1. Diluir la suspensión de sangre o médula con 2-4 volúmenes de PBS que contenga 2% de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM de EDTA. N.B. Volúmenes más altos aumentan la pureza de las CPM.
    2. En un tubo cónico de 50 ml, colocar cuidadosamente 35 ml de la suspensión celular diluida sobre 15 ml de Ficoll-paque. Centrifugar a 400g durante 30 min. en un rotor de cubeta oscilante sin freno.
    3. Aspire la capa superior dejando intacta la capa intermedia de MNC.
    4. Transfiera la capa de interfase (que contiene las MNC) a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    5. Añada PBS que contenga 2% de FBS y 2 mM de EDTA para llenar este tubo, mezcle suavemente invirtiendo el tubo y centrifugue a 300g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
    6. Lave el sedimento celular 2 veces adicionales para eliminar las plaquetas. N.B. Este paso aumenta la pureza de CD34+ células
    7. Tome 20 μl de la suspensión celular y colóquelos en un tubo eppendorf. Añada 200 μl de tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla 1) e incube a temperatura ambiente durante 2 min. Coloque 18 μl de esta suspensión bajo un hemocitómetro y cuente las MNC nucleadas.
    8. Las MNC pueden usarse inmediatamente o congelarse a 108 célula/ml en medio de cultivo celular que contiene 10% de DMSO y almacenado en nitrógeno líquido.
  3. Aislar CD34+ células mediante selección inmunomagnética positiva (Figura 1-Paso 1)
    Utilizamos el Kit de Microperlas CD34 (que contiene una solución de microperlas conjugadas con anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD34 humano y una solución de reactivo bloqueador de FcR que contiene IgG humana) en combinación con dos columnas LS Mini-MACS, el tampón de funcionamiento autoMACS y un separador MiniMACS (Tabla 1). A continuación describimos nuestro protocolo a partir de 2,3x10⁸8 MNCs. Si se utilizan diferentes números de células, los volúmenes deben ajustarse proporcionalmente. Además, para hasta 2x108 MNCs a MS MiniMacs se puede utilizar en lugar de la columna LS MiniMacs.
    Mantenga las células y los reactivos fríos (4-8 °C) para prevenir la formación de capuchones de anticuerpos en la superficie celular y la marcación celular inespecífica.
    1. Resuspenda el precipitado que contiene 2,3x108 MNC en 690 μl de tampón de corrida (300 μl por 108 MNC, donde 300 μl es el volumen mínimo de suspensión requerido) y transferir a un tubo cónico de 15 ml.
    2. Añada 230 μl de reactivo bloqueador de FcR
    3. Añada 230 μl de la solución de microperlas CD34.
    4. Mezcle bien manualmente e incube durante 30 min a 4 °C.
    5. Lave las células añadiendo 10 ml de tampón de lavado y centrifugue a 300g durante 10 min.
    6. Aspire completamente el sobrenadante.
    7. Resuspenda las células en 1,2 ml de tampón de corrida (utilice 0,5 ml de tampón por cada 108 MNC N.B. Es importante obtener una suspensión de células individuales antes de la separación magnética. Si es necesario, pase las células a través de una malla de nailon de 30 μm para eliminar los agregados celulares.
    8. Prepare la columna LS colocándola en el campo magnético de un separador MiniMACS.
    9. Lave la columna con 3 ml de tampón de lavado.
    10. Aplique 1,2 ml de la suspensión celular sobre la columna.
    11. Recopile el flujo atravesante y utilícelo para verificar el rendimiento y la pureza de las células CD34+ aislamiento celular. Alternativamente, congele las células contenidas en esta fracción y almacénelas en nitrógeno líquido. N.º Esta fracción contiene células no marcadas y también puede contener algunas células CD34 marcadas+ células que no se adhirieron a la columna.
    12. Lave la columna tres veces con 3 ml de tampón de lavado, combine los lavados y utilice esta fracción de manera similar a la fracción del flujo inicial anterior.
    13. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo colector de polipropileno de 15 ml.
    14. Para eluir las células, agregue 5 ml de tampón de corrida a la columna y eluya inmediatamente las células CD34 marcadas+ células presionando firmemente el émbolo dentro de la columna.
    15. Repita el procedimiento de purificación en columna (pasos h a n) pasando las células a través de una columna LS recién preparada. N.B. Esto aumenta la pureza de CD34+ células. A partir de una suspensión de 2,3x108 MNC aisladas de leucoaféresis, típicamente obtenemos 1,1x106 CD34+ células con una pureza > 95±3% (Figura 1-Paso 1).
    16. Congele las células en medio de cultivo que contenga 10% de DMSO y almacénelas en nitrógeno líquido o continúe directamente con el paso 2).

2. Diferenciación eritroide en cultivo celular

Las células CD34+ se cultivan en medio IMDM suplementado con suministro secuencial de hidrocortisona y combinaciones específicas de citocinas según un protocolo de cuatro pasos adaptado de 6 (Figura 1-Paso 2). Se realiza una serie de pruebas a lo largo del procedimiento para verificar el crecimiento celular y la diferenciación eritroide.

La cantidad de células CD34+ necesarias para iniciar un cultivo es variable y depende de la escala del experimento. Típicamente, para estudios de expresión génica realizamos un cultivo a pequeña escala comenzando con 0,1x106 células CD34+ en 10 ml de medio, manteniendo volúmenes pequeños mediante la congelación de células adicionales a lo largo del procedimiento. Para estudios en los que se requiere extracción de proteínas, los cultivos se realizan a mayor escala. Aquí describimos un experimento a gran escala en el que partimos de aproximadamente 7x106 células CD34+ aisladas de leucoaféresis.
Se mantienen condiciones estériles durante todo el proceso. Véanse las tablas 1, 2 y 3 para conocer los reactivos.

  1. Preparar reactivos
    1. Prepare el medio IMDM suplementado según se describe en la Tabla 2 y congele alícuotas de 40 ml a -20°C (puede hacerse con antelación).
    2. Prepare soluciones stock de hidrocortisona y citoquinas según se describe en la Tabla 3.
  2. Paso 1: Día 0-11
    Las células hematopoyéticas se cultivan en medio IMDM suplementado que contiene hidrocortisona (HC), factor de células madre (SCF), interleucina 3 (IL-3) y eritropoyetina (EPO) (Tabla 3). Las células estromales murinas de médula ósea MS-5 (Tabla 1) se amplifican en preparación para el Paso 2.
    • Día 0:
      1. Caliente previamente 120 ml de medio IMDM suplementado y añada HC, SCF, IL-3 y EPO (Tabla 3).
      2. Descongele 7x106 células CD34+ colocando primero el (los) vial(es) en un baño de agua a 37°C. Mientras las células aún estén congeladas, añada 1 ml de medio precalentado y transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Lave el vial con 2 ml de medio y transfiera al tubo de 15 ml.
      3. Añada 6 ml de medio al suspensión celular, mezcle invirtiendo el tubo y centrifugue a 200 g durante 5 min.
      4. Aspire el sobrenadante y re suspenda el sedimento celular en 10 ml de medio fresco.
      5. Contar las células viables usando un hemocitómetro tras mezclar 10 μl de suspensión celular con 10 μl de solución de Azul de Tripano (Tabla 1). NB: La muerte celular es de aproximadamente 25% durante el descongelamiento, por lo que la concentración de células viables debería ser ~0.5x106 células/ml.
      6. Guarde aproximadamente 3 ml de suspensión celular para pruebas (véase el párrafo 6).
      7. Transfiera los 7 ml restantes a un matraz T-175 y añada 63 ml de medio para obtener 0.05x106 células/ml en 70 ml, y coloque el matraz en un incubador a 37°C.
    • Día 1:
      1. Caliente previamente 85 ml de medio de cultivo para células MS-5: αMEM con Glutamax (Tabla 1), 10% SFB y 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina.
      2. Prepare tres placas redondas de cultivo de 150 mm x 25 mm, cada una sembrada con 2x106 células MS-5 en 25 ml de medio para obtener 0.08x106 células/ml y colóquelas en un incubador a 37°C. NB: Se obtienen mejores resultados utilizando células MS-5 de bajo pase (<20). El cultivo confluyente debe expandirse dividiendo 1:5 cada tercer día usando tripsina que contenga 0.05% de EDTA.
    • Día 2:
      1. Contar las células hematopoyéticas con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte las células necesarias (es decir, ~20 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: En nuestra experiencia, durante los primeros 2 días, la muerte celular puede superar el 30-50% y, por tanto, la concentración final de células suele estar cerca de la del Día 0 (Figura 2).
      2. Reemplace el medio de cultivo de las células MS-5 con 25 ml de medio fresco asegurándose de eliminar las células MS-5 que no se han adherido.
    • Día 4:
      1. Contar las células hematopoyéticas con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte las células necesarias (es decir, ~10 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: En este punto, las células deberían haber comenzado a proliferar con >75% de células viables a una concentración de ~0.2x106 células/ml. Las células pueden congelarse a 1-2x106 células/ml en medio IMDM suplementado que contiene 10% de DMSO y almacenarse en nitrógeno líquido.
      2. Transfiera los ~40 ml restantes de cultivo a un matraz T-175 y añada suficiente medio IMDM suplementado que contenga HC, SCF, IL-3 y EPO (Tabla 3) para alcanzar un volumen final de 150 ml. NB: La concentración celular debe ser de ~0.05x106 células/ml.
      3. Expanda las células MS-5 (que deberían estar 60-70% confluentes) diluyéndolas 1:5 en nuevas placas de cultivo redondas de 150 mm x 25 mm usando tripsina 0.05% EDTA. La concentración final de células debe ser de ~0.08x106 células/ml. NB: Habitualmente, una placa puede expandirse 5 veces, de modo que debería tener 15 placas de células MS-5 a ~0.08x106 células/ml.
    • Día 6:
      1. Contar las células hematopoyéticas con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~5 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: Las células están en una etapa de alta proliferación y la concentración celular debe mantenerse ≤1.5x106 células/ml. Si la concentración es mayor, añada medio IMDM suplementado fresco que contenga HC, SCF, IL-3 y EPO.
    • Día 7:
      1. Contar las células hematopoyéticas con Azul de Tripano para excluir células muertas. NB: En nuestra experiencia, las células suelen alcanzar una densidad de 1.5x106 células/ml el Día 7.
      2. Añada suficiente medio para mantener una concentración celular de ~0.8x106 células/ml. NB: Habitualmente añadimos 100 ml de medio IMDM suplementado fresco que contiene HC, SCF, IL-3 y EPO para obtener 245 ml de células a ~0.8x106 células/ml.
      3. Expanda las células MS-5 (que deberían estar 60-70% confluentes) diluyéndolas 1:5 en matraces T-175 (en lugar de placas) usando tripsina 0.05% EDTA. La concentración final de células debe ser de ~0.08x106 células/ml. NB: Deben prepararse 61 matraces de células MS-5 a ~0.08x106 células/ml. Congele las células MS-5 restantes y almacénelas en nitrógeno líquido.
    • Día 8:
      1. Contar las células hematopoyéticas con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~5 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular debe ser de ~1x106 células/ml.
      2. Caliente previamente 2 L de medio IMDM suplementado que contenga solo SCF y EPO (Tablas 2 y 3).
      3. Recolecte 200 ml de cultivo hematopoyético (que contiene ~200x106 células), centrifugue a 200 g durante 10 min, aspire el sobrenadante y re suspenda el sedimento celular en 40 ml de medio IMDM suplementado que contenga SCF y EPO.
      4. Reparta la suspensión celular en 8 matraces T-175 (5 ml por matraz) y añada 245 ml de medio IMDM suplementado que contenga SCF y EPO a cada matraz. NB: Ahora tenemos 8 matraces, cada uno con 250 ml de células a 0.1x106 células/ml.
      5. Las células restantes (~40 ml) el Día 8 pueden congelarse a 1-2x106 células/ml en medio IMDM suplementado que contiene 10% DMSO y almacenarse en nitrógeno líquido.
    • Día 10:
      1. Contar las células hematopoyéticas con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~5 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular debe ser de ~1x106 células/ml.
  3. Paso 2: Día 11-15
    Se recolecta aproximadamente la mitad de las células para uso futuro (por ejemplo, extracción nuclear). Las células eritroides restantes se cultivan en co-cultivo sobre células MS-5 en medio IMDM suplementado que contiene EPO (Tablas 2 y 3). Las células eritroides deben transferirse a una nueva capa de MS-5 cada 3-4 días.
    • Día 11:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas. NB: La densidad celular debe ser de ~1.5x106 células/ml.
      2. Caliente previamente 1 L de PBS 1x, 400 ml de medio IMDM suplementado y 5 L de medio IMDM suplementado que contenga EPO (Tablas 2 y 3) a 37°C.
      3. Reserve un volumen de cultivo equivalente a 15x108 células (por ejemplo, ~4 matraces de 250 ml cada uno) y continúe con el punto e.
      4. Las células restantes (por ejemplo, 15x108) se recolectan en tubos cónicos, centrifugan a 450 g durante 10 min, se re suspenden en tampón MS30 frío (Tabla 5) que contiene 0.1 mM DTT usando un máximo de 108 células/ml y se almacenan a -80°C tras congelación rápida en nitrógeno líquido para uso futuro (por ejemplo, extracto nuclear).
      5. Lave 50 matraces de células MS-5 confluentes con 20 ml de PBS 1x cada uno e inmediatamente añada 80 ml de medio IMDM suplementado fresco que contenga EPO en cada matraz. NB: Debido al gran número de matraces, procesamos 4 matraces a la vez. Específicamente, retiramos 4 matraces de células MS-5 confluentes del incubador, los lavamos con PBS 1x, añadimos 80 ml de medio y devolvemos los matraces al incubador. Cuando todos los matraces están preparados y devueltos al incubador, continuamos con el paso f. Debido al número de matraces que deben procesarse en un procedimiento a gran escala, es beneficioso que dos personas realicen estos pasos simultáneamente.
      6. Centrifugue el equivalente a 15x108 células eritroides en 4 tubos cónicos a 450 g durante 10 min y deseche el sobrenadante.
      7. Lave los 4 sedimentos celulares con 100 ml cada uno de medio IMDM suplementado.
      8. Re suspenda cada sedimento celular en 250 ml de medio IMDM suplementado que contenga EPO y distribuya 20 ml de esta suspensión celular a cada uno de los 50 matraces que contienen células MS-5 y 80 ml de medio. NB: En este paso, debería tener 50 matraces con células MS-5 confluentes que contengan 100 ml de células eritroides a 0.3x106 células/ml.
      9. Expanda los 11 matraces restantes de células MS-5 diluyéndolos 1:5 en matraces T-175 usando tripsina 0.05% EDTA. La concentración final de células debe ser de ~0.08x106 células/ml. NB: Deben prepararse 55 matraces de células MS-5 a ~0.08x106 células/ml.
    • Día 12:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~4 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular debe ser de ~0.6x106 células/ml.
    • Día 14:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~3 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular debe ser de ~0.9x106 células/ml.
  4. Paso 3: Día 15-18
    Se recolectan algunas células para uso futuro (por ejemplo, extracción nuclear). Las células eritroides restantes se cultivan en co-cultivo sobre células MS-5 en medio IMDM suplementado sin citoquinas.
    • Día 15:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas. NB: La densidad celular debe ser de ~1x106 células/ml.
      2. Caliente previamente 1 L de PBS 1x y 5 L de medio IMDM suplementado (Tabla 2) a 37°C.
      3. Reserve un volumen de cultivo equivalente a 10x108 células (por ejemplo, ~10 matraces de 100 ml cada uno) y continúe con el punto e.
      4. Las células restantes (por ejemplo, 40x108) se recolectan y re suspenden en tampón MS30 frío (Tabla 5) que contiene 0.1 mM DTT para uso futuro (véase el Paso 2: Día 11 punto d).
      5. Lave 50 matraces de células MS-5 confluentes con 20 ml de PBS 1x cada uno e inmediatamente añada 80 ml de medio IMDM suplementado fresco en cada matraz.
      6. Centrifugue el equivalente a 10x108 células eritroides en 4 tubos cónicos a 450 g durante 10 min y deseche el sobrenadante.
      7. Lave los 4 sedimentos celulares con 100 ml cada uno de medio IMDM suplementado.
      8. Re suspenda cada sedimento celular en 250 ml de medio IMDM suplementado y distribuya 20 ml de esta suspensión celular a cada uno de los 50 matraces que contienen células MS-5 y 80 ml de medio. NB: En este paso, debería tener 50 matraces con células MS-5 confluentes que contengan 100 ml de células eritroides a 0.2x106 células/ml.
      9. Expanda los 5 matraces restantes de células MS-5 diluyéndolos 1:5 en matraces T-175 usando tripsina 0.05% EDTA. La concentración final de células debe ser de ~0.08x106 células/ml. NB: Deben prepararse 20 matraces de células MS-5 a ~0.08x106 células/ml. Congele las células MS-5 restantes y almacénelas en nitrógeno líquido.
    • Día 16:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~4 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular debe ser de ~0.6x106 células/ml.
  5. Paso 4: Día 18-26
    Las células eritroides se concentran 3-4 veces para obtener una concentración final de 5-7x106 células/ml y se mantienen sobre la capa de MS-5 para permitir su maduración. Se añade 10% de SFB al medio IMDM suplementado para permitir una mejor conservación de los glóbulos rojos cultivados (cRBCs).
    • Día 18:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~2 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular debe ser de ~1.7x106 células/ml.
      2. Caliente previamente 300 ml de PBS 1x y 1.5 L de medio IMDM suplementado (Tabla 2) que contenga 10% de SFB a 37°C.
      3. Lave 15 matraces de células MS-5 confluentes con 20 ml de PBS 1x cada uno e inmediatamente añada 80 ml de medio IMDM suplementado fresco en cada matraz.
      4. Centrifugue las células eritroides (es decir, el equivalente a 85x108 células) a 450 g durante 10 min, combine y distribuya el sedimento en 4 tubos cónicos.
      5. Re suspenda cada sedimento celular en 75 ml de medio IMDM suplementado que contenga 10% de SFB y distribuya 20 ml de esta suspensión celular a cada uno de los 15 matraces que contienen células MS-5 y 80 ml de medio. NB: En este paso, debería tener 15 matraces con células MS-5 confluentes que contengan 100 ml de células eritroides a 6x106 células/ml.
      6. Expanda los 5 matraces restantes de células MS-5 diluyéndolos 1:5 en matraces T-175 usando tripsina 0.05% EDTA. La concentración final de células debe ser de ~0.08x106 células/ml. NB: Deben prepararse 20 matraces de células MS-5 a ~0.08x106 células/ml. Congele las células MS-5 restantes y almacénelas en nitrógeno líquido.
    • Día 20:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~1.5 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular se mantiene en ~1.5x106 células/ml.
    • Día 22:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~1.5 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular se mantiene en ~1.5x106 células/ml.
      2. Cambie el medio y transfiera las células eritroides a nuevas capas de células MS-5 según se describe para el Día 18.
    • Día 24:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~1.5 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular se mantiene en ~1.5x106 células/ml.
    • Día 26:
      1. Contar las células eritroides con Azul de Tripano para excluir células muertas, y recolecte el número necesario de células (es decir, ~1.5 ml de cultivo) para pruebas (véase el párrafo 6). NB: La densidad celular se mantiene en ~1.5x106 células/ml.
      2. Recolecte los cRBCs enucleados no adherentes y completamente hemoglobinizados. NB: Los cRBCs maduros pueden conservarse en medio SAGM (MacoPharma) a 4°C durante hasta un mes.
  6. Pruebas y resultados representativos
    Las siguientes pruebas se realizan en los días indicados para verificar la proliferación celular adecuada y la diferenciación eritroide. Los resultados representativos presentados en las figuras se obtuvieron utilizando células CD34+ aisladas de leucoaféresis.
    1. Las células se cuentan cada dos días. Véase el resultado representativo de la proliferación celular en la Figura 2.
    2. Se realiza tinción morfológica de May-Grünwald Giemsa cada dos días usando 0.05 x106 células para los Días 0 a 8 y 0.2x106 células para los demás días, siguiendo las instrucciones del fabricante de la tinción Giemsa (Tabla 1). Véase los resultados representativos en la Figura 3.
    3. Los ensayos en medio semisólido se realizan por duplicado para medir progenitores hematopoyéticos cada dos días desde el Día 0 hasta el Día 12 usando 0.01x106 células por ensayo, siguiendo las instrucciones del fabricante del medio semisólido Methocult (Tabla 1). Véase los resultados representativos en la Figura 4.
    4. El análisis de los siguientes marcadores celulares se realiza cada dos días mediante FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS usando 0.2 x106 células por ensayo. Véase los resultados representativos en la Figura 5.
    5. La hemoglobina se mide cada dos días mediante tinción con benzidina. Véase los resultados representativos en la Figura 5.
    6. La expresión génica se estudia mediante RT-qPCR o microarrays tras la extracción de ARN de 1x106 células. Véase los resultados representativos en la Figura 6B.

Comentarios sobre los resultados:

La Figura 1 describe el protocolo para la diferenciación ex vivo de células CD34+ humanas hacia glóbulos rojos maduros que contienen hemoglobina. Durante la diferenciación eritroide, las células son altamente proliferativas, como se ilustra mediante la amplificación de aproximadamente 8.000 veces mostrada en la Figura 2, obtenida utilizando células CD34+ aisladas de leucoaféresis. Las células CD34+ aisladas de médula ósea son ligeramente menos proliferativas, con una amplificación de aproximadamente 6.000 veces, mientras que las células CD34+ aisladas de sangre de cordón pueden alcanzar una amplificación de 50.000 veces. Las células en etapas específicas de diferenciación presentan tamaños y morfologías reconocibles que se ilustran en la Figura 3. Obsérvese el proceso de enucleación que ocurre al final de la diferenciación, a partir del día 20. En el día 26, todas las células han perdido sus núcleos (Figura 3).

Los ensayos de formación de colonias mostrados en la Figura 4 se utilizan para detectar progenitores hematopoyéticos tempranos y tardíos durante los primeros días de diferenciación (Día 0 al Día 8). Además de los progenitores eritroides (CFU-E y BFU-E), observamos que los progenitores granulocito-macrófagos (CFU-GM) están significativamente representados dentro de las células CD34+ tempranas en el Día 0. A medida que avanza la diferenciación, los CFU-GM disminuyen significativamente y, en el Día 6, han sido completamente reemplazados por los progenitores eritroides BFU-E y CFU-E. También es importante destacar que, del Día 4 al Día 6, los progenitores eritroides tempranos BFU-E son progresivamente reemplazados por sus contrapartes más diferenciadas, CFU-E. Para el Día 10, las células eritroides han perdido esencialmente su capacidad de formar colonias.

Finalmente, la eritropoyesis se monitorea mediante la expresión de marcadores de superficie celular, como se muestra en la Figura 5. Nota: 1) la pérdida progresiva del marcador de células madre/progenitoras hematopoyéticas CD34; 2) la adquisición y pérdida progresivas del marcador progenitor CD36; 3) la adquisición y pérdida progresivas del marcador de progenitor eritroide y reticulocito CD71; y 4) el aumento del marcador de precursor eritroide y eritrocito GPA. Otros marcadores de diferenciación eritroide incluyen la síntesis de hemoglobina a partir del día 8 (medida mediante tinción con benzidina, Figura 5) y la enucleación celular a partir del día 20, medida por la pérdida de la tinción de ADN con LDS (Figura 5). Finalmente, la diferenciación eritroide puede cuantificarse mediante RT-qPCR de marcadores moleculares como el factor de transcripción TAL1 (Figura 6B) o los genes de β-globina (datos no mostrados).

Típicamente, 1 ml de sangre de cordón / leucoaféresis / médula ósea proporciona 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 células CD34+ que, teóricamente, pueden producir 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 glóbulos rojos con tasas de proliferación respectivas de 50.000 / 8.000 / 6.000. Para obtener 50x106 glóbulos rojos al final del procedimiento de diferenciación, se necesitarán aproximadamente 50 ml de medio de cultivo.

Parte II. Silenciamiento mediado por lentivirus durante la diferenciación eritroide ex vivo

El lentivirus es una herramienta de elección para la transferencia génica en células primarias humanas (véase, por ejemplo, Amsellem et al. 9). Los lentivirus se utilizan frecuentemente para silenciar genes de interés en células primarias mediante la entrega de ARNh dirigido (véase, por ejemplo, Laurenti et al. 10). En este protocolo, dirigimos el factor de transcripción TAL1 en células eritroides primarias humanas. Se utiliza un ARNh con una secuencia aleatorizada que no corresponde a ningún gen conocido como control negativo. La expresión de GFP se emplea para evaluar la eficiencia de transducción.

1. Preparación de partículas de vectores lentivirales

Para obtener partículas lentivirales, las células de riñón embrionario humano 293T se transfectan simultáneamente con tres plásmidos: uno que incluye un sistema de empaquetamiento viral de segunda generación que codifica para los genes del VIH-1 excepto env, vpr, vif, vpu y nef (es decir, psPAX2); uno que codifica para la envoltura del virus pseudotipado con la glicoproteína G de la estomatitis vesicular (es decir, pMD2G); y un vector lentiviral que codifica para el gen de interés (es decir, pBLOCK-it6-DEST(shTal1) que codifica para el ARNip de TAL1, pBLOCK-it6-DEST(shScr) que codifica para un ARNip aleatorio o pWPIP que codifica para GFP) (Tabla 4). Las partículas lentivirales se recolectan del sobrenadante del cultivo celular de las células 293T transfectadas.

Para evitar infecciones no deseadas de las células, realizamos todos los experimentos con lentivirus (preparación de virus e infección) bajo una campana dedicada, separada del resto de los cultivos celulares. Además, los desechos generados por lentivirus se descartan por separado. Los lentivirus de segunda generación descritos en este protocolo son incapaces de replicarse y deben tratarse como organismos de Nivel de Bioseguridad 2. Algunas instituciones podrían tener procedimientos específicos de seguridad respecto a los lentivirus, y recomendamos seguir las directrices institucionales establecidas.

Aquí describimos un protocolo que proporcionará suficientes partículas lentivirales para infectar entre 1 y 2 millones de células eritroides primarias en cualquier etapa de diferenciación. Los volúmenes deben ajustarse adecuadamente si se escala el procedimiento hacia arriba o hacia abajo. Véanse las Tablas 4 y 5 para los reactivos.

  1. Transfección de células 293T con fosfato de calcio.
    1. Un día antes de la transfección, sembrar 13,2 x 106 células 293T en 20 ml de medio DMEM/alto contenido de glucosa que contenga 10 % de FBS y Pen/Estrepto en un plato de cultivo celular de 15 cm. Nota: Esto permitirá que las células alcancen una confluencia del 70 % el día de la transfección. Se obtienen los mejores resultados utilizando células 293T de bajo pase (<20).
      Opcional: los platos pueden recubrirse con colágeno tipo I o con poli-L-lisina para mejorar la adherencia de las células 293T.
    2. Dos horas antes de la transfección, aspirar el medio de las células 293T y añadir suavemente 20 ml de medio fresco precalentado a 37 °C. Nota: Habitualmente comenzamos la transfección al final del día.
    3. Mezclar los siguientes reactivos en un tubo de 5 ml:
      • 44,8 μg de vector de expresión para el gen de interés (por ejemplo, shRNA o GFP, ver Tabla 4)
      • 13,35 μg de vector de envoltura pMD2.G.
      • 33,48 μg de vector de empaquetamiento psPAX2.
      • Añadir agua estéril suficiente para completar un volumen de 1,116 ml.
    4. Añadir agua estéril suficiente para completar un volumen de 1,116 ml.
    5. Añadir 109,8 μl de CaCl2 2,5 M y mezclar mediante vortex.
    6. En un tubo cónico de 50 ml, añadir 1,116 ml de tampón 2xHBS (Tabla 5).
    7. Bajo agitación constante mediante vortex, añadir la mezcla de ADN gota a gota al tampón 2xHBS.
    8. Dejar formar el precipitado a temperatura ambiente durante 20 min (no más de 30 min).
    9. Añadir la solución de 2,3 ml gota a gota al plato que contiene las células 293T, agitar suavemente y transferir las células a un incubador a 37 °C durante 12-14 horas.
    10. A primera hora de la mañana siguiente, aspirar el medio y reemplazarlo con 20 ml de medio fresco precalentado a 37 °C.
  2. Recolección y concentración del lentivirus
    1. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, recolectar 20 ml de medio que contenga el lentivirus y colocarlos en un tubo cónico de 50 ml.
    2. Añadir 20 ml de medio precalentado a 37 °C a las células 293T y devolverlas al incubador.
    3. Centrifugar el sobrenadante viral a 450 g durante 10 min para eliminar cualquier resto celular y transferirlo a un nuevo tubo de 50 ml. Alternativamente, el sobrenadante puede filtrarse a través de un filtro de 0,45 μm. Guardar el sobrenadante clarificado a 4 °C.
    4. Veinticuatro horas después, recolectar los 20 ml restantes de medio. Nota: Observamos que los títulos virales son aproximadamente equivalentes en ambas recolecciones, es decir, 1x 106 U/T/ml.
    5. Para concentrar los virus, los sobrenadantes virales se distribuyen en tubos Beckman OptiSeal (utilizar 32,4 ml de sobrenadante por tubo) y se centrifugan a 100.000 g durante 1,5 h a 4 °C utilizando un rotor de balanceo. Nota: Otros métodos alternativos para concentrar el sobrenadante viral incluyen la centrifugación a 47.000 g durante 2 h o a 3.000 g durante 8 h. No congele el virus antes de la concentración. La congelación provocará la precipitación de proteínas, dificultando la resuspensión del virus.
    6. Inmediatamente después de la ultracentrifugación, aspirar lentamente el sobrenadante utilizando una pipeta plástica de 10 ml y desecharlo. Nota: Tenga cuidado de no perturbar el precipitado, que puede desprenderse fácilmente del tubo. Después de desechar los primeros 5 ml de sobrenadante, habitualmente cortamos la parte superior del tubo de ultracentrifugación para facilitar la eliminación del mayor volumen posible de sobrenadante, es decir, dejar aproximadamente 100-200 μl de medio en el fondo del tubo.
    7. Añadir 100 μl de PBS 1x, dejar que el precipitado se disuelva a temperatura ambiente durante 30 min y resuspender mediante pipeteo ascendente y descendente de 15 a 20 veces. Nota: Habitualmente obtenemos unos 200-300 μl de virus concentrado.
    8. La preparación concentrada de lentivirus se titula en células NIH3T3 utilizando un protocolo de Invitrogen (Sistema de expresión de ARNi lentiviral Block-it). Nota: Habitualmente obtenemos títulos virales de 2 a 10x108 unidades transducentes (U/T)/ml.
    9. El virus ya puede utilizarse para infección (ver apartado 2) o fraccionarse y almacenarse a -80 °C durante hasta 6 meses. Nota: No someta las suspensiones virales a más de un ciclo de congelación-descongelación. Los virus son estables durante 4-5 h a 37 °C, 2-3 días a temperatura ambiente o una semana a 4 °C.

2. Infección con lentivirus de células eritroides primarias para la entrega de genes

  1. Infección
    Las células eritroides nucleadas pueden infectarse eficazmente en cualquier etapa de diferenciación siempre que se utilice una alta MOI (multiplicidad de infección) de 50-100. A continuación se describe un experimento típico en el que se utilizan lentivirus que expresan un ARNip contra TAL1 o un ARNip de control aleatorio para infectar células eritroides en los días 8 y 9 de diferenciación, usando una MOI de 50 UT/célula. Se extrae ARN cada 24 horas para verificar el nivel de silenciamiento de TAL1 mediante RT-qPCR. La expresión de GFP se mide en paralelo mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia de infección (véanse los resultados representativos en la Figura 6).
    • Día 0:
      1. Preparar tres tubos cónicos de 15 ml que contengan 1x106 células eritroides cada uno (es decir, un tubo para el silenciamiento de TAL1, un tubo para el control negativo aleatorio y un tubo para el control de expresión de GFP).
      2. Lavar las células con 5 ml de medio IMDM suplementado que contenga SCF y EPO (véase la Parte I), centrifugar a 200 g durante 5 min. y eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante.
      3. Añadir polibreno (Tabla 4) hasta una concentración final de 40 μg/ml a la solución de virus concentrado.
      4. Añadir 100 μl de virus concentrado (es decir, 5x107 UT) que contenga polibreno a cada tubo de células eritroides.
      5. Incubar durante 1 h en el incubador a 37°C y mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo cada 10 min. N.B. la infección debe realizarse con volúmenes mínimos de medio para permitir una máxima adsorción del lentivirus sobre las células. Además, mezclar cada 10 min. permite una distribución uniforme del virus entre las células.
      6. Añadir 900 μl de medio IMDM suplementado que contenga SCF y EPO (Tablas 2 y 3) a cada tubo.
      7. Transferir cada muestra a una placa de 6 pocillos y colocarla en el incubador a 37°C durante 24 h.
    • Día 1: Recoger las células en tubos separados de 15 ml, centrifugarlas a 200 g durante 5 min., eliminar el sobrenadante y repetir la infección (pasos b a g anteriores).
    • Día 2: Lavar las células y resuspenderlas a 0,2x106 células/ml en medio IMDM suplementado que contenga SCF y EPO, y continuar según se describe en la Parte I.
  2. Resultados representativos
    La Figura 6A ilustra el protocolo de infección con lentivirus de células eritroides primarias seguido de extracción de ARN. En un experimento, infectamos células eritroides con lentivirus que producían un ARNip dirigido contra el factor de transcripción TAL1 o un control aleatorio 11. La Figura 6B muestra que logramos silenciar el 75 % de los transcritos de TAL1 en células eritroides primarias. Obsérvese también el aumento del nivel de transcritos de TAL1 del día 9 al día 12 en el control aleatorio, lo que subraya la importancia de este factor de transcripción durante la diferenciación eritroide. En otro experimento, infectamos células eritroides con lentivirus que expresaban la proteína GFP. La Figura 6C muestra que tres días después de la infección, la mayoría de las células eritroides (87 %) expresaban GFP, como se midió mediante fluorescencia al microscopio y citometría de flujo. Esto indica una alta eficiencia de infección en células eritroides primarias. Previo a esto, habíamos infectado células CD34+ en el día 0 con una eficiencia de infección similar (datos no mostrados). El parámetro más importante para lograr una transducción eficiente de células primarias es utilizar una MOI alta (es decir, lentivirus concentrados). Si se utiliza una MOI baja (es decir, virus no concentrado), la eficiencia de transducción disminuirá.

3. Resultados representativos

Diagrama de aislamiento positivo de CPHs CD34+; separación inmunomagnética, diferenciación eritroide libre de suero.
Figura 1. Esquema del protocolo para el aislamiento y diferenciación eritroide ex vivo de células madre/progenitoras hematopoyéticas primarias humanas. (Paso 1) Las células CD34+ (pureza del 95 ± 3 %) se aíslan de sangre de cordón, médula ósea o sangre periférica humana movilizada con G-CSF (leucoaféresis) mediante selección inmunomagnética positiva. (Paso 2) Las células CD34+ se cultivan en medio líquido según el protocolo indicado de cuatro pasos.

Gráfico de amplificación celular; escala logarítmica; análisis de la tendencia del crecimiento celular frente a los días de cultivo.
Figura 2. Amplificación celular durante el protocolo de diferenciación eritroide ex vivo. Los resultados están en escala logarítmica. Resultados representativos obtenidos con células CD34+ aisladas de leucoaféresis.

Gráfico de las etapas de la eritropoyesis, imágenes microscópicas que siguen el desarrollo de los glóbulos rojos durante 26 días.
Figura 3. Análisis de la morfología celular durante la diferenciación eritroide ex vivo. Las células se tiñen con el reactivo de May-Grünwald-Giemsa en los puntos de tiempo indicados durante la diferenciación (aumento x 40). HSC: células madre/progenitoras hematopoyéticas; BFU-E: unidades formadoras de brotes –eritroides; CFU-E: unidades formadoras de colonias –eritroides; Pro EB: proeritroblastos; Baso EB: eritroblastos basófilos; Poly EB: eritroblastos policromatófilos; Ortho EB: eritroblastos ortocromáticos; RET: reticulocitos; RBC: glóbulos rojos.

Gráfico de ensayo semisólido; crecimiento de progenitores CFU-GM, BFU-E, CFU-E; días de cultivo celular; comparación de imágenes.
Figura 4. Ensayos de células formadoras de colonias (CFC) para detectar y cuantificar progenitores hematopoyéticos. En los puntos de tiempo indicados, 104 células se sembraron en un medio semisólido de metilcelulosa en presencia de citocinas humanas recombinantes: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO para favorecer el crecimiento óptimo de progenitores eritroides (BFU-E y CFU-E) y progenitores de granulocitos y macrófagos (CFU-GM). BFU: unidades formadoras de brotes; CFU: unidades formadoras de colonias. También se muestra una imagen típica de BFU-E y CFU-E. Obsérvese el color rojo-marrón debido a la hemoglobinización de BFU-E y CFU-E.

Gráficos de diferenciación hematopoyética que muestran los marcadores celulares CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidina, LDS a lo largo del tiempo.
Figura 5. Cinética de los marcadores hematopoyéticos/eritroides durante la diferenciación eritroide ex vivo. En los puntos de tiempo indicados, se recolectaron 2x105 células y se analizó la expresión de los marcadores indicados mediante citometría de flujo (CD34, CD36, CD71, GPA y LDS) o mediante microscopía (Benzidina). Las barras representan los porcentajes de células positivas. CD34: glicoproteína transmembrana, presente en células madre/progenitoras hematopoyéticas humanas; CD36: receptor de trombospondina, presente en células progenitoras; CD71: receptor de transferrina, presente en progenitores eritroides y reticulocitos; GPA: glicoforina A, presente en precursores eritroides y eritrocitos; Benzidina: tinción de hemoglobina; LDS: colorante láser estirilo, tinción de ADN.

Línea de tiempo de la infección con lentivirus shRNA, gráfico de barras de expresión de ARNm de TAL1, microscopía GFP, citometría de flujo.
Figura 6. Transferencia génica mediada por lentivirus en proeritroblastos primarios humanos. (A) Línea de tiempo para la inducción del silenciamiento de TAL1 (KD) en proeritroblastos primarios mediante el sistema de entrega génica con lentivirus. (B) El silenciamiento de TAL1 fue mediado por shRNA anti-Tal1 entregado por lentivirus (TAL1 KD) o por un shRNA de control aleatorio (Scr). La cinética del nivel de transcripción de ARNm de TAL1 se midió mediante RT-qPCR. La transcripción de TAL1 se expresa en relación con el ARN 18S. (C) La expresión de GFP entregado por lentivirus se evaluó mediante microscopía (panel izquierdo) o FACS (panel derecho). El 87 % de las células fueron positivas para GFP.

4. Materiales

ReactivoOrigenNúmero de catálogo
RPMI 1640 SigmaR8758
Colagenasa BRoche Applied Science11088807001
DNasa ISigmaD5025-15KU
Filtros previos a la separación (malla de nailon de 30 μm)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
Tampón EasySep 10x de lisis de glóbulos rojosStemCell Technologies20120
Kit de Microperlas CD34Miltenyi Biotec Inc130-046-703
Columnas LS Mini-MACSMiltenyi Biotec Inc130-042-401
Tampón de funcionamiento autoMACS – Tampón de separación MACSMiltenyi Biotec Inc130-091-221
Separador MiniMACSMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Células estromales de médula ósea de ratón MS-5 (ensayadas regularmente para contaminación por micoplasma)DSMZACC 441
Solución de azul de tripano (0,4 %)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Tripsina 0,05 % / EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Ensayos Methocult de formación de colonias (CFC) para células humanas StemCell Technologies 04044

Tabla 1.

ComponenteSolución madreVolumen 600 ml
IMDMSigma I3390443,4 ml
Penicilina/estreptomicina 1% (vol/vol)Gibco 103786 ml
L-glutamina 4x10-3M200 mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40 μg/ml4 mg/ml (Sigma I5125)
preparación: Disolver 28 mg de polvo en 7 ml de IMDM y filtrar para esterilizar; estable durante 1 semana a 4 °C.		6 ml
Ácido fólico 10 μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
preparación: Disolver 7 mg de polvo en 7 ml de IMDM previamente calentado y filtrar para esterilizar; estable durante 1 semana a 4 °C. Calentar antes de usar.		6 ml
Monotiolglicerol 1,6x10-4M0,16 M (Sigma M6145)
preparación: Disolver 10 μl de la solución madre 11,56 M en 712 μl de IMDM y filtrar para esterilizar; estable durante 1 semana a 4 °C.		0,6 ml
Nitrato férrico 90 ng/ml18 μg/ml (Sigma 8508)
preparación: Disolver 1,8 mg en 1 ml de agua destilada. Tomar 0,1 ml, añadir 9,9 ml de IMDM y filtrar para esterilizar; estable durante 1 semana a 4 °C.		3 ml
Sulfato ferroso 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
preparación: Disolver 18 mg en 1 ml de agua destilada. Tomar 0,1 ml, añadir 9,9 ml de IMDM y filtrar para esterilizar; estable durante 1 semana a 4 °C.		3 ml
Albúmina sérica bovina-insulina-transferrina (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tabla 2.

ComponenteSolución stockVolumen a añadir a 100 ml de IMDM suplementado (Tabla 2)
Hidrocortisona (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
preparación: Disolver 5 mg de polvo en 1,03 ml de IMDM. Tomar 0,1 ml, añadir 9,9 ml de IMDM y filtrar para esterilizar. Estable durante 1 semana a 4 °C.		1 ml
Factor de células madre (SCF) 100 ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
preparación: Disolver 50 μg de polvo en 500 μl de PBS + 0,1 % BSA y filtrar para esterilizar. Preparar alícuotas de 100 μl y almacenar a -20 °C.		100 μl
Eritropoyetina (EPO) 3 UI/ml100 μg/ml equivalente a 12.000 UI/ml (Feldan FB03-10-290)
preparación: Disolver 50 μg de polvo en 500 ml de PBS + 0,1 % BSA y filtrar para esterilizar. Preparar alícuotas de 25 ml y almacenar a -20 °C.		25 μl
Interleucina 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
preparación: Disolver 10 μg de polvo en 100 μl de PBS + 0,1 % BSA y filtrar para esterilizar. Preparar alícuotas de 5 ml y almacenar a -20 °C.		5 μl

Tabla 3.

ReactivoOrigenReferencia
Células 293T
(probar regularmente la contaminación por micoplasma)		ATCCCRL-11268
DMEM/Glucosa altaThermoScientificSH30243.01
Bromuro de hexadimetrina (Polybrene)SigmaH9268-5G
Tubos de ultracentrifugación OptiSealBeckman Coulter361625
Plásmido psPAX2Addgene (laboratorio D. Trono)12260
Plásmido pMD2.GAddgene (laboratorio D. Trono)12259
Plásmido pBLOCK-it6-DEST (shTal1)Secuencia de ARNih Tal1 clonada en el plásmido pBLOCK-it6-DEST de InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plásmido pBLOCK-it6-DEST (shScr)Secuencia de ARNih aleatoria clonada en el plásmido pBLOCK-it6-DEST de InvitrogenPalii et al. EMBO J.
Plásmido pWPIAddgene (laboratorio D. Trono)12254

Tabla 4.

TampónPreparaciónConcentración final
2xHBS
  • 1.6 g de NaCl
  • 1.3 g de HEPES
  • 0.04 g de Na2HPO4(7H2O)
  • Añadir agua Milli-Q.
  • Ajustar el pH exactamente a 7.11-7.13 añadiendo solución de NaOH y completar con agua Milli-Q hasta 100 ml.
  • Refinar el pH a 7.11-7.13.
  • Filtrar para esterilizar, fraccionar en alícuotas de 10 ml y almacenar a -200C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g de CaCl2 anhidro
  • Disolver en 10 ml de agua Milli-Q.
  • Filtrar para esterilizar, fraccionar en alícuotas de 1 ml y almacenar a -20°C
  • 2.5M
MS30
  • 25 ml de Tris [2M] pH 8.0
  • 5 ml de EDTA [0.5M]
  • 300 ml de glicerol
  • 50 mM
  • 2.5 mM
  • 30% (v/v)

Tabla 5.

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Discusión

Una serie de métodos se han utilizado previamente para diferenciar las células eritroides en la cultura, con grados variables de éxito. Por ejemplo, algunos protocolos, sin co-cultivo de MS-5 permite la expansión de las células eritroides, pero no son eficientes en la producción de células completamente maduros enucleados rojos 12-17. Mientras que otros métodos permiten la enucleación eficiente, es a expensas de la proliferación de 18,19. El método que hemos utilizado aquí, inicialmente desarrollad...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Agradecemos a L. Douay y MC Giarratana (Universidad de París VI, Francia) para el asesoramiento en la diferenciación eritroide ex vivo, D. Allan H. y Atkins (OHRI, Canadá) para proporcionar muestras de sangre (obtenida en el Hospital de Ottawa de Ética de Investigación de la Junta # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) para proporcionar a los vectores lentiviral y FJ Dilworth (OHRI, Canadá) para la lectura crítica del manuscrito. Este proyecto fue financiado por una subvención CIHR (MOP-82813) para MBCGP es un beneficiario de una investigación Ontario Fondo Computacional Becas de Formación Postdoctoral Regulomics. MB titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en el Reglamento de la expresión génica.

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Referencias

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  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
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