Transducción de las células humanas con polímeros complejos Lentivirus ecotropic de Mayor Seguridad de la Biotecnología

Resumen

Los lentivirus son una valiosa herramienta de investigación para explorar la función del gen, sin embargo, los investigadores desean evitar la producción de la codificación de lentivirus pantropic conocidos o sospechosos oncogenes. Como alternativa, se presenta un protocolo más seguro para el uso de lentivirus ecotropic en las células humanas modificadas para expresar el receptor mSlc7a1 ecotropic.

Resumen

Madre y el tumor de estudios de la biología celular a menudo requieren la transducción viral de las células humanas con oncogenes conocidos o sospechosos, que planteaba cuestiones importantes de seguridad para el personal de laboratorio. Lentivirus Pantropic, tales como el uso común VSV-G pseudotipo, son una herramienta valiosa para estudiar la función génica, ya que pueden transducir muchos tipos de células, incluyendo las células no se dividen. Sin embargo, los investigadores desean evitar la producción y la centrifugación de los virus pantropic codificación oncogenes debido a los mayores requerimientos de manejo de nivel de bioseguridad y seguridad. Varios oncogenes potentes, incluyendo c-Myc y SV40 antígeno T grande, son conocidos por aumentar la producción de células madre pluripotentes inducidas (IPSC). Todas las otras iPSC que induce cambios genéticos (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28, y la pérdida de la función de p53) también tienen enlaces con el cáncer, lo que los problemas de seguridad relativamente alto, así.

Aunque estos virus relacionados con el cáncer son útiles en el estudio de la reprogramación celular y pluripotencia, deben utilizarse de manera segura. Para abordar estas cuestiones de bioseguridad, se demuestra un método para la transducción de células humanas con lentivirus ecotropic, con énfasis adicional en el costo reducido y fácil manejo. Hemos producido lentivirus ecotropic con título suficientemente alto como para la transducción de más del 90% de los receptores de las células que expresan humanos expuestos al virus, la validación de la eficacia de este enfoque.

Lentivirus se concentra a menudo por ultracentrifugación, sin embargo, este proceso dura varias horas y puede producir aerosoles infecciosos para la salud humana de los investigadores biomédicos. Como una alternativa de partículas, viral puede ser más segura sedimentado en las células por la formación de complejos con sulfato de condroitina y polibreno (CS / PB). Esta técnica aumenta el título viral funcional hasta 3 veces en células que expresan establemente receptores retrovirus murino, con el tiempo añadido y el coste insignificante. Transducción de los fibroblastos dérmicos humanos (HDFs) es la máxima mejorada utilizando CS / PB concentraciones aproximadamente cuatro veces menor que el valor óptimo se ha informado de líneas celulares de cáncer, lo que sugiere que la concentración de polímero se debe ajustar para el tipo de célula diana de interés. Por lo tanto, describen el uso de methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio (MTT) para el ensayo de toxicidad de polímero en un nuevo tipo de células. Se observa la viabilidad equivalente de HDFs después de la transducción viral utilizando complejos polímero o la dosis estándar de polibreno (PB, 6 mg / ml), lo que indica un mínimo de toxicidad aguda.

En este protocolo, se describe el uso de lentivirus ecotropic para la sobreexpresión de los oncogenes en las células humanas, lo que reduce los riesgos de bioseguridad y el aumento de la tasa de transducción. También demostrar el uso de complejos de polímeros para mejorar la transducción, evitando la formación de aerosoles centrifugación de las partículas virales.

Protocolo

1. Producción, recolección y congelación de lentivirus

1. Consulte a su responsable institucional de seguridad antes de comenzar este protocolo y siga sus pautas de seguridad recomendadas.
2. Día 1. Comience con células 293T sanas y de crecimiento rápido para producir el virus. Siembre las células a 5 x 10⁶ células por placa de 10 cm. Utilice medio para 293T sin antibióticos (DMEM de alta glucosa con 10 % de FBS y 4 mM de L-glutamina) para la producción del virus.
3. Día 2. Por la tarde, transfecte las células 293T como sigue (los valores indicados corresponden a una placa de 10 cm). Deje que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Pipetee 375 μl de OptiMEM en un tubo de microcentrifugadora y luego añada 25 μl de Fugene HD. No permita que el Fugene sin diluir entre en contacto con la superficie del tubo.
4. En un tubo de microcentrifugadora, mezcle:
   • 5 μg de plásmido de transferencia (Slc7a1, vector diana o vector de control fluorescente)
   • 3,75 μg de plásmido de empaquetamiento (pCMV-dR8.91 o psPax2)
   • 1,25 μg de plásmido de envoltura (pMD2.G para pantrópico, pHCMV-EcoEnv para ectrópico)
   • OptiMEM sin suero hasta completar 100 μl
5. Combine los dos tubos e incube la mezcla durante 20-30 minutos a temperatura ambiente.
6. Cambie el medio de las células 293T por 10 ml de medio fresco sin antibióticos para 293T. Añada la mezcla de Fugene/plásmido gota a gota sobre la placa e incube durante la noche a 37 °C y 5 % de CO₂.
7. Día 3. Cambie el medio de las células 293T por 10 ml de medio fresco sin antibióticos para 293T. Sea cuidadoso, ya que las células 293T se adhieren débilmente y pueden desprenderse si se pipetea el medio con demasiada fuerza sobre la monocapa. Incube durante dos días en un incubador humedecido para la producción del virus.
8. Día 5. Recolecte el virus y filtre mediante un filtro de baja unión a proteínas de 0,45 mm. Úselo inmediatamente o distribúyalo en alícuotas de un solo uso y congélelo a -80 °C. El virus pantrópico y ectrópico congelado debe volver a titularse después de seis meses y un mes de almacenamiento, respectivamente.
9. Titule el virus como sigue, utilizando células relativamente susceptibles a la transducción. Transduzca las células durante la noche con el virus de control fluorescente usando diluciones seriadas (por ejemplo, 1:10, 1:100, 1:1000) en medio fresco con 6 μg/ml de PB. Al día siguiente, cambie a medio fresco. Permita que las células expresen la proteína fluorescente durante dos días tras la transducción y luego determine la fracción de células transducidas mediante citometría de flujo (FACS). Calcule la titulación en unidades transformantes (TU) por ml, basándose en las diluciones que produzcan < 15 % de transducción para minimizar eventos de transducción múltiple.
   

2. Transducción de células diana humanas con el receptor de retrovirus murino Slc7a1

1. Seleccione una multiplicidad de infección (MOI) = 2 para asegurar que la mayoría de las células serán transducidas. Para células diana resistentes a la transducción, como los HDF, se requerirá un MOI más alto; diluimos el sobrenadante viral solo 1:2 para lograr la transducción de la mayoría de las células.
2. Transduzca las células diana durante la noche con sobrenadante viral diluido en medio de cultivo fresco con 6 μg/ml de PB, lo cual aumenta la transducción al mejorar la interacción electrostática entre el virus y la célula diana.¹ Idealmente, se debe usar un volumen mínimo de virus, como 1 ml para una placa de 35 mm, ya que la difusión es un factor limitante en la eficiencia de transducción.
3. Cultive las células durante al menos 48 horas después de retirar el virus antes de transducirlas con virus ecrótrofo, con el fin de asegurar una expresión suficiente del receptor Slc7a1.
4. (Opcional) Es posible usar blasticidina para seleccionar células transducidas establemente que expresen Slc7a1, si se desea. Se debe generar previamente una curva de letalidad con blasticidina para determinar la concentración efectiva más baja, generalmente entre 2 – 10 μg/ml, que mate a todas las células diana no transducidas en 7 días. Aproximadamente 2 días después de retirar el virus Slc7a1, cambie las células transducidas a medio que contenga blasticidina. Cultive las células en medio con blasticidina durante 7 días, momento en el cual todas las células restantes expresarán establemente el receptor del retrovirus, y entonces podrán ser transducidas con virus ecrótrofo, así como almacenadas para uso futuro como una línea estable que expresa Slc7a1.

3. Titulación de complejo de polímero para determinar la toxicidad

1. Día 1. Sembrar células a 5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos, dejando al menos tres pocillos por cada grupo experimental. Incluir células no transducidas en medio completo para obtener un valor basal de células sanas, así como muestras de células en medio sin suero para inducir el arresto del crecimiento como control. En paralelo, sembrar células en un formato adecuado (por ejemplo, una placa de 24 pocillos) para el análisis microscópico o mediante FACS de la eficiencia de transducción en cada condición experimental.
2. Día 2. Transducir las células en las placas preparadas para los análisis de MTT y FACS con virus que exprese GFP, a una MOI de 0,5 para transducir aproximadamente el 40 % de las células diana. Probar distintas concentraciones de CS/PB (por ejemplo, 50, 100, 200, 400, 600 y 800 mg/ml de cada componente), así como 6 μg/ml de PB, para determinar las cantidades óptimas. Generar complejos poliméricos según se describe en la Parte 4, más adelante.
3. Día 3. Eliminar el medio que contiene el virus y reemplazarlo por medio fresco. Devolver las placas a una incubadora humedecida.
4. Día 5. Analizar la placa de FACS para determinar la eficiencia de transducción con cada concentración de polímero.
5. Día 6. Eliminar el medio de todos los pocillos de la placa de MTT y reemplazarlo por 100 μl de solución de MTT (1 mg/ml de MTT en medio completo). Incubar durante tres horas en una incubadora humedecida para permitir la reducción del MTT en las mitocondrias de las células metabólicamente activas.
6. Eliminar la solución de MTT y reemplazarla por 200 ml de disolvente de MTT (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 en isopropanol).
7. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente o hasta que todo el precipitado púrpura de formazán de MTT se haya disuelto completamente. Leer la absorbancia en un lector de microplacas a 570 nm, restando la lectura de fondo a 690 nm.
8. Seleccionar la concentración óptima de polímero que produzca el máximo aumento en la transducción, según se determine mediante FACS, con el menor efecto sobre la actividad metabólica, según se determine mediante MTT. Para las HDF, seleccionamos 100 μg/ml de CS/PB basándonos en los datos mostrados en los Resultados Representativos, más adelante.

4. Transducción ecotrópica con complejación polimérica

1. Prepare soluciones stock de PB y sulfato de condroitina filtradas estérilmente a 20 mg/ml en agua. Aliquote y almacene a -20°C.
2. Aspire el sobrenadante viral en un tubo de microcentrifugado y dilúyalo hasta la concentración final deseada (por ejemplo, MOI de 2) con medio de cultivo fresco. Añada volúmenes iguales de PB y sulfato de condroitina (concentraciones determinadas en el paso 3 anterior) sucesivamente, agitando ligeramente el tubo para mezclar tras cada adición. La mezcla viral se volverá turbia inmediatamente conforme se formen precipitados. Incube la mezcla viral a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la formación del complejo.
3. Retire el medio de las células diana que expresan el receptor, sustitúyalo por la mezcla viral e incube durante la noche a 37°C, 5% CO2. Tras retirar la mezcla viral, lave la superficie de las células dos veces con PBS para ayudar a eliminar los complejos virales. No es necesario eliminarlos por completo; no hemos observado efectos adversos en la salud celular debidos a complejos poliméricos residuales.

5. Verificación de la especificidad de la transducción ecótrofica

1. Al producir por primera vez un virus ecotrópico, es prudente, desde una perspectiva de seguridad, verificar que el virus no sea capaz de transducir células humanas no modificadas. Transduzca células humanas con lentivirus ecotrópico a una concentración relativamente alta (solo una dilución de 1 a 2 veces del sobrenadante viral en medio fresco) durante la noche con 6 μg/ml de PB o con la concentración optimizada de CS/PB.
2. Elimine el medio que contiene el virus y reemplácelo con medio fresco. Después de incubar las células durante 2 días, valide la expresión del transgén mediante citometría de flujo (FACS) utilizando vectores fluorescentes y/o mediante RT-PCR con cebadores específicos para el transgén.

6. Resultados representativos:

La figura 1A muestra el proceso de producción de lentivirus, y la figura 1B muestra la transducción de células humanas con lentivirus ecotrópico, incluyendo la pretransducción con el receptor de retrovirus murino Slc7a1. Para la titulación del virus, utilizamos una línea celular de rabdomiosarcoma humano transducida establemente con Slc7a1 (Slc-hRMS). Al utilizar vectores de control fluorescentes para monitorear la eficiencia de transducción, habitualmente alcanzamos una eficiencia de transducción > 90% de Slc-hRMS con virus ecotrópico, como se muestra en las figuras 2A y 2B. Las tasas de transducción de HDFs son generalmente más bajas porque las células no han sido seleccionadas con blasticidina para la expresión del receptor (figura 2C). Los títulos de lentivirus ecotrópico son generalmente del 10-20% de los del virus pseudotipado con VSV cuando se miden en Slc-hRMS (figura 2D).

Un ciclo de congelación-descongelación reduce el título del virus ecotrópico en un 16 - 3%, lo que equivale a la pérdida de título durante un único ciclo de congelación-descongelación del virus pseudotipado con VSV (p > 0,05). Contrariamente a informes previos,² no observamos ningún efecto positivo en el título vírico al congelar rápidamente en hielo seco. Más bien, obtenemos títulos posteriores a la descongelación más altos para cualquiera de los pseudotipos simplemente colocando los tubos de virus en un congelador a -80°C (datos no mostrados).

El ensayo de viabilidad MTT permite la detección sensible del arresto del crecimiento en células diana. La transducción con virus más concentraciones de CS/PB hasta 800 μg/ml no tiene efecto sobre el metabolismo de los HDF (Fig. 3A). La exposición a CS/PB sin virus tampoco tiene efecto tóxico sobre las células (datos no mostrados). El análisis por FACS de HDF transducidos con virus más diversas concentraciones de CS/PB muestra una mejora en la transducción en comparación con PB solo (Fig. 3B). La máxima mejora ocurre a 100 μg/ml de CS/PB (Fig. 3C), varias veces menor que los valores previamente reportados.³ Por lo tanto, es importante optimizar las condiciones para cualquier tipo celular diana dado.

La complejación con CS/PB mejora aproximadamente 3 veces el título observado en Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0.01). En la práctica, esto produce un efecto mayor en la eficiencia de transducción a bajas concentraciones de virus que a concentraciones más altas (Fig. 4B), lo cual probablemente se deba a células transducidas múltiples veces y a la saturación de receptores a concentraciones elevadas de virus.

La transducción con virus ecrótropo es específica para células que expresan el receptor de retrovirus murino. Al transducir células humanas no modificadas con virus ecrótropo, no hemos observado fluorescencia mayor que el fondo de no transducción, ya sea utilizando PB o CS/PB, como se muestra en la Figura 5A. Microscópicamente, los HDF no muestran transducción en ausencia del receptor (Figura 5B), mientras que la pretransducción con el receptor da como resultado células fluorescentes (Figura 5C).

Figura 1. Vista esquemática de (A) el proceso de producción del virus y (B) la transducción de células humanas con receptor retroviral murino seguida por lentivirus ecotrópico.

Figura 2. Transducción de alta eficiencia de células humanas con lentivirus ecotrópico que codifica GFP. Las células fueron pretransducidas con el receptor de retrovirus murino Slc7a1. (A) Línea celular de rabdomiosarcoma humano seleccionada con blasticidina para Slc7a1 (Slc-hRMS), transducida (azul) o no transducida (rosa) con GFP. (B) Micrografía fluorescente de Slc-hRMS transducidas con ecotrópico (4X). (C) HDFs transducidos (azul) y no transducidos (rosa) con lentivirus ecotrópico GFP; las células fueron transducidas con Slc7a1 dos días antes de la transducción ecotrópica. (D) Título del lentivirus pseudotipado con VSV-G y del lentivirus ecotrópico, medido en Slc-hRMS.

Figura 3. Optimización de las concentraciones de sulfato de condroitina/poliabreno (CS/PB) en fibroblastos dérmicos humanos. (A) Viabilidad de los HDF evaluada mediante el ensayo MTT tras la transducción en presencia de PB solo o con distintas concentraciones de CS/PB. (B) Mejora de la eficiencia de transducción en HDF mediante diferentes concentraciones de CS/PB, medida por citometría de flujo (FACS). (C) Cuantificación del aumento en la transducción, que muestra que la transducción máxima ocurre con 100 μg/ml de CS/PB.

Figura 4. Efecto de 400 μg/ml de CS/PB en la transducción de Slc-hRMS con lentivirus ecotrópico. (A) Mejora del título, y (B) cambio en la tasa de transducción en comparación con 6 μg/ml de polibren solo.

Figura 5. Ausencia de transducción ecótrofa de HDF en ausencia del receptor de retrovirus murino Slc7a1. (A) Gráfico de citometría de flujo de fibroblastos humanos BJ, no transducidos (rosado) o transducidos (azul) con lentivirus ecótrofo GFP, en ambos casos en ausencia del receptor Slc7a1. Fibroblastos humanos BJ transducidos con lentivirus ecótrofo GFP, sin (B) y con (C) pretransducción con el receptor Slc7a1 (4X).

Discusión

Recombinante gammaretrovirus ecotropic basado en el virus de la leucemia murina Moloney (MLV) y su receptor mSlc7a1 están bien estudiadas y ampliamente disponible, después de haber sido utilizado por más de 20 años para ofrecer los transgenes en las células murinas. Gammaretrovirus ecotropic también se ha utilizado más recientemente para ofrecer oncogenes a las células humanas;. En el marco de la reprogramación celular, el uso de mSlc7a1 para evitar la generación de virus anfotrópico albergar oncogenes humanos está bien establecida ^4,5 Sin embargo, lentivirus ofrece ventajas significativas sobre gammaretrovirus en la transducción de las poblaciones de células refractarias, ⁶ incluidas las células primarias que a menudo son objetivos deseables para la reprogramación, ya que el lentiviral pre-integración compleja permite la transducción de la no división de las células ^7.

Los lentivirus se han producido decenas de pseudotipos diferentes, incluyendo MLV, en un esfuerzo por alterar el tropismo del virus, la toxicidad y otras propiedades. ^8-MLV pseudotyped lentivirus ecotropic se ha utilizado para la transducción de células de ratón, ^9, pero rara vez se ha utilizado en las células humanas ^10. Por tanto, proponemos el uso de MLV pseudotyped lentivirus ecotropic como un vehículo seguro, rentable y altamente eficiente para entregar oncogenes conocidos o sospechosos, incluyendo factores de reprogramación celular, las células humanas.

Es importante notar que este protocolo no se elimina totalmente la necesidad de producir y utilizar lentivirus pantropic, sino que este protocolo se separa del oncogén (s) del virus de la pantropic, el aislamiento de los investigadores del potencial de auto-inoculación con virus relacionados con el cáncer. El mSlc7a1 proteína y su homólogo humano hSlc7a1 se expresó doquier transportadores de aminoácidos sin tumorigenicidad conocido o capacidad de conferir una ventaja selectiva de crecimiento de las células receptoras, ¹¹ mSlc7a1 realización de un riesgo relativamente bajo para su incorporación en anfotrópico virus. Este paso adicional puede ser especialmente útil en los laboratorios carecen de virus dedicados o instalaciones de cultivo de tejidos del nivel de bioseguridad necesarias.

En algunas situaciones puede ser posible eliminar por completo el uso de virus pantropic mediante la transferencia de la Slc7a1 plásmido directamente en las células diana, sin embargo, muchas células que sería útil para los objetivos de esta técnica también son refractarios a la transfección. Como alternativa, la posibilidad de aislar Slc7a1-células transducidas por la selección blasticidin significa que VSV-G lentivirus pseudotyped puede ser usado una vez para generar una acción de los receptores de las células que expresan, tras lo cual puede ser el virus de ecotropic utilizarse de forma rutinaria para la transducción de estas células para muchos experimentos. Los investigadores siempre deben seguir las directrices de seguridad institucional para trabajar con cualquier lentivirus, independientemente de su tropismo.

Los títulos de virus ecotropic logra con este protocolo son ligeramente inferior a la VSV-pseudotyped virus, por lo general el 10-20% de los títulos de virus pantropic, de acuerdo con estudios anteriores. ⁹ Estos títulos se midieron en las células humanas establemente transducidas con Slc7a1, por lo que el menor título observado para el virus de ecotropic puede deberse en parte a la expresión variadas del gen del receptor en las células diana. Sin embargo, los títulos virales obtenidos en nuestro protocolo es más que suficiente para la mayoría de las aplicaciones y llevar a la transducción de la mayoría de las células, en algunos casos> 90% de las células.

Basado en las técnicas de centrifugación se utilizan para concentrar las partículas virales. Sin embargo, la centrifugación requiere varias horas, genera aerosoles infecciosos, y puede resultar en una pérdida significativa de partículas virales. ¹² Como alternativa, la formación de complejos con CS / PB se pueden utilizar para mejorar la transducción, sin alterar el tropismo viral. ³ Este método es rápido (5 minutos ) y de bajo costo ($ 0,03 por el virus de 10 ml), mientras que aproximadamente el triple del título observado. Ningún equipo especial o de los reactivos de esta naturaleza se requiere, y se observó toxicidad aguda mínima después de la exposición de HDFs a CS / PB, de acuerdo con trabajos previos en otras líneas celulares. ¹³ Un posible inconveniente de este protocolo es que algunos de los complejos polímero visibles al microscopio se adhieren a las células durante varios días en la cultura. No podemos descartar la posibilidad de que estos complejos, aunque no visiblemente tóxicas para las células, pueden tener efectos más sutiles en los procesos celulares.

Aquí hemos descrito una metodología para la seguridad y eficiencia de transducción de células humanas con factores oncogénicos. Este enfoque debe ser de gran utilidad para los investigadores que estudian los oncogenes y la biología de células madre, incluyendo las células iPS.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murino receptor MLV
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G sobre
pCMV-dR8.91	D. Trono de laboratorio 14		Embalaje plásmido (plásmido psPax2 equivalente está disponible en Addgene, cat. Número 12.260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Sobre ecotropic
FUGW	Addgene	14883	GFP plásmido de control
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimetrina bromuro (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
El sulfato de condroitina sal sódica del cartílago de tiburón	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Pescador	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021