Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Resumen

Este trabajo presenta una citometría de flujo basado en el método para investigar la composición inmunológica de aortas. El documento también muestra una técnica adicional que permite examinar los alrededores y adventicia pared de los vasos por separado. Este método abre la posibilidad de realizar análisis fenotípico de los leucocitos aórtica y aplicar varios ensayos inmunológicos para los estudios de la aterosclerosis.

Resumen

La aterosclerosis es un proceso inflamatorio crónico de los barcos de tamaño medio y grande que se caracteriza por la formación de placas consiste en células espumosas, células del sistema inmune, las células vasculares endoteliales y de músculo liso, plaquetas, la matriz extracelular, y un núcleo rico en lípidos, con extensa necrosis y fibrosis de los tejidos circundantes. ¹ Los brazos innata y adaptativa de la respuesta inmune están implicados en la iniciación, desarrollo y la persistencia de la aterosclerosis. ^{2, 3} hay un importante cuerpo de evidencia de que los diferentes subconjuntos de las células inmunes, como los macrófagos, dendríticas las células, los linfocitos T y B, están presentes en las aortas de los ratones sanos y con tendencia ^{aterosclerosis-4.} Además, las células inmunes se encuentran en la adventicia aórtica rodea lo que sugiere un papel importante de este tejido en la aterogénesis. ²

Desde hace algún tiempo, la detección cuantitativa de los diferentes tipos de células del sistema inmune, su estado de activación, y la composición celular dentro de la pared de la aorta se vio limitada por RT-PCR y los métodos de inmunohistoquímica para el estudio de la aterosclerosis. Pocos intentos se hicieron para realizar citometría de flujo utilizando aortas humanos, y una serie de problemas, tales como una alta autofluorescencia, se han reportado ^5,6. Las placas ateroscleróticas humanas fueron digeridos con colagenasa 1, y se recogieron las células libres y se tiñeron de CD14 + / + CD11c para destacar derivada de macrófagos en células espumosas. En este estudio, un "simulacro" de canal se utiliza para evitar falsos positivos tinción. ⁶ material necrótico acumulado durante el proceso de digestión dar lugar a una gran cantidad de desechos que genera una alta autofluorescencia en las muestras de la aorta. Para resolver este problema, un panel de controles positivos y negativos se ha propuesto, pero sólo la doble tinción se podría aplicar en estas muestras. Hemos desarrollado un nuevo flujo de citometría basado en el método ⁷ para analizar la composición de las células inmunitarias y caracterizar la activación, proliferación, diferenciación de las células inmunes en aorta sana y propenso aterosclerosis. Este método permite la investigación de la composición de las células inmunes de la pared aórtica y abre la posibilidad de utilizar una amplia gama de métodos inmunológicos para la investigación de los aspectos inmunológicos de la enfermedad.

Protocolo

1. El aislamiento de aortas murino

La aprobación del comité institucional IACUC del procedimiento es necesario para trabajar con ratones.

1. Prepare heparinzed PBS mediante la adición de 1000 unidades de heparina sódica a 50 ml de PBS y la vuelta al tubo para mezclar. Preparar un tubo de recogida de vacío para la sangre y un tubo de colección que contiene PBS para cada aorta para ser recogidos. Mantenga todos los tubos en hielo.
2. Heparinizar una jeringa para extraer sangre (0,1 ml de Heparina sódica 1000 U / ml), preparar las herramientas quirúrgicas (dos pares de pinzas curvas, un par de tijeras de disección, y un par de....

Discusión

A continuación, presentamos un método de la citometría de flujo basado en la investigación de la composición de las células inmunes de aortas murino. La principal ventaja de este método es la capacidad de analizar la aorta células del sistema inmune en un nivel de células individuales y para caracterizar el estado de activación de los leucocitos aórtica. Este método no se limita a aortas murino y nosotros (datos no publicados) y otras ^{10 personas} utiliza este enfoque para analizar las muestras humanas, como l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material	Número de catálogo	Empresa
Colagenasa XI	C7657	Sigma-Aldrich
Hialuronidasa	H3506	Sigma-Aldrich
DNasa I, tipo 2	D4527	Sigma-Aldrich
Colagenasa I	C0130	Sigma-Aldrich
Colagenasa II	LS004174	Worthington Biochemical Corp.
Elastasa	LS002292	Worthington Biochemical Corp.