Aquí se describe un rendimiento de alta eficiencia In situ (ISH) método para la visualización de patrones de expresión de ARNm en el desarrollo fetal del ratón secciones de tejido de próstata. El método puede ser fácilmente adaptado para visualizar los patrones de expresión de ARNm en tejidos de ratón o en otros tejidos de otras especies.
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Artículo de método
Un alto rendimiento In situ Método de hibridación para caracterizar los patrones de expresión de ARNm en el ratón Fetal del tracto urogenital inferior
En este artículo
Resumen
Resumen
Desarrollo del tracto urogenital inferior (LUT) es un proceso complejo. Esta complejidad se pone de manifiesto durante la formación de la próstata desde la uretra masculina fetal, que se basa en las señales de andrógenos y epitelio-mesenquimal 1,2 interacciones. Comprender los mecanismos moleculares responsables del desarrollo de la próstata pueden revelar los mecanismos de crecimiento que están inadecuadamente despertado tarde en la vida para dar lugar a enfermedades de la próstata como la hiperplasia prostática benigna y cáncer de próstata.
La LUT en desarrollo es anatómicamente compleja. Por el momento incipiente de próstata comienza en 16,5 días después de la concepción (DPC), numerosos tipos de células están presentes. Vasos, nervios y el músculo liso de residencia en el estroma mesenquimal 3. Este estroma rodea un epitelio de varias capas y da lugar a la próstata del feto a través del receptor de andrógenos dependientes de las señales paracrinas 4. La identidad de la estroma del receptor de andrógenos que responden a los genes necesarios para el desarrollo de la próstata y el mecanismo por el cual la próstata formas epitelio ductal en respuesta a estos genes no se entiende completamente. La capacidad de identificar con precisión los tipos de células y localizar la expresión de factores específicos dentro de ellos es imprescindible para comprender mejor el desarrollo de la próstata. La hibridación in situ (ISH), permite la localización de los ARNm dentro de un tejido. Por lo tanto, este método puede ser utilizado para identificar patrón y el momento de la expresión de moléculas de señalización y sus receptores, con lo que los reguladores de dilucidar el potencial de desarrollo de próstata.
Aquí se describe una técnica de alto rendimiento ISH para identificar los patrones de expresión de ARNm en el LUT ratón fetal con vibración micrótomo secciones de corte. Este método ofrece varias ventajas sobre otros protocolos de ISH. Realización de ISH en secciones delgadas adherido a una diapositiva es técnicamente difícil, con frecuencia tienen cryosections calidad estructural de los pobres, mientras tanto cryosections y secciones de parafina a menudo resultan en la resolución de la señal es débil. Realización de ISH sobre todo tejidos de montaje puede resultar en la captura de la sonda. Por el contrario, nuestra técnica de alto rendimiento utiliza corte grueso secciones que muestran la arquitectura del tejido detallada. Modificado tubos de microcentrífuga permiten un fácil manejo de las secciones durante el procedimiento de ISH. Un máximo de 4 transcripciones de ARNm pueden ser examinados a partir de una sola LUT 17.5dpc con un máximo de 24 transcripciones de ARNm detectados en un solo plazo, reduciendo así costes y maximizar la eficiencia. Este método permite que varios grupos de tratamiento para ser procesado de forma idéntica y como una sola unidad, eliminando así cualquier sesgo de interpretación de los datos. Más pertinente para los investigadores de la próstata, este método proporciona una ubicación espacial y temporal de las transcripciones de ARNm de alta y baja abundancia en la uretra del ratón fetal que da lugar a la red de próstata ductal.
Protocolo
1. Síntesis de un riboprobe digoxigenina-11-UTP-etiqueta de una plantilla de PCR generados por
- Para sintetizar un riboprobe de genes específicos, el uso de Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) para obtener la secuencia del gen de referencia cDNA (RefSeq). Utilice el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 para el diseño de genes específicos de PCR en contra de la región 3 'de la secuencia de cDNA. Parámetros recomendados para la selección de cebadores de PCR se describen en otra parte (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- Utilice el programa de Megablast (http://w....
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Discusión
Utilizando el método descrito aquí, es posible detectar mRNAs en todos los principales tipos de células y los compartimentos de tejido de la LUT de ratón fetal hombres y mujeres incluyendo las pastillas de origen mesenquimal, urotelio, músculo liso, los brotes de próstata, conducto eyaculador y la vagina. Las secciones de 50 micras utilizado en este protocolo tiene la ventaja de ser lo suficientemente gruesa como para resolver la arquitectura del tejido (por ejemplo, los vasos sanguíneos), pero son lo suficientemente de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Dra. Lan Yi, Instituto del Cáncer de Nueva Jersey, para la asistencia técnica en la preparación de cestas de tejido. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DK083425 y DK070219.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Anticuerpo anti-digoxigenina, fragmentos Fab | Roche Applied Science | 11214667001 | |
| El bloqueo de los reactivos | Roche Applied Science | 11096176001 | |
| BM Purple sustrato AP, lo que precipitó | Roche Applied Science | 11442074001 | |
| Albúmina de suero bovino | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Placa de cultivo celular, 24 y | Corning | 3524 | |
| Digoxigenina-UTP 11 | Roche Applied Science | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 | |
| De doble filo navaja de rasurar | Wilkinson Sword | Modelo clásico | |
| Eliminase RNasa removedor | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamida | Sigma | F5786-1L | |
| Gel kit de extracción | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehído, solución al 25% en H 2 O | Sigma | G6257-100ML | |
| La heparina, la sal de sodio | Sigma | H3393 | |
| De peróxido de hidrógeno, solución al 30% en H 2 O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisol | Sigma | L9756 | |
| Loctite 404 configuración rápida adhesivo instantáneo | Henkel Corp. | 46551 | |
| Cloruro de magnesio | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Ácido maleico | Sigma | M0375-500G | |
| Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml | Biologix Empresa de Pesquisa | BP337-100 | |
| Cultura Millicell placa de inserción | Millipore | PICM01250 | |
| Resina molecular de molienda | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehído, solución al 4% en tampón fosfato salino | Affymetrix | 19943 | |
| Tampón fosfato salino sin Ca y Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Malla de poliéster, de 33 micras, 12 "x 24" | Pequeñas piezas Inc | CMY-0033-D | |
| Proteinasa K solución, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| Columnas QIAshredder | Qiagen | 79654 | |
| Q solución | Qiagen | Siempre con la polimerasa de ADN Taq | |
| RNasa | Sigma | R6513 | |
| Inhibidor de RNasa | Roche Applied Science | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNasa libre de DNasa | Promega | M6101 | |
| SeaPlaque bajo punto de fusión de agarosa | Lonza | 50101 | |
| Suero de oveja | Sigma | S2263-500 ml | |
| Stericup unidad de filtro, 0.22μm, polietersulfona, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Azida de sodio, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Dodecilsulfato de sodio | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solución | Investigación de Productos Internacionales | S24022-4000.0 | |
| Superíndice III primer capítulo de síntesis del sistema | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polimerasa | Roche Applied Science | 10881767001 | |
| Taq ADN polimerasa | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibración micrótomo con baño ejemplar de lujo | Leica Microsystems | VT1000A | |
| TRNA de levadura | Roche Applied Science | 109495 |
Referencias
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R.
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Reimpresiones y permisos
