Summary
نقدم بروتوكول مفصلة لالأجرعية بوساطة الجينات التي يسببها فيروس مقايسة (VIGS) في إسكات القطن. تم نشر فيروس حشرجة التبغ (TRV) المشتقة VIGS ناقلات للحث على الحمض النووي الريبي إسكات من القطن GrCLA1 ، Cloroplastos alterados 1 الجينات. وقد لوحظ النمط الظاهري البيضاء التي يسببها إسكات GrCLA1 في مرحلة الشتلات في حدود 2 أسابيع بعد التلقيح.
Abstract
القطن (الكرسف أزغب) هي واحدة من أهم المحاصيل في جميع أنحاء العالم. وقد بذلت جهود كبيرة في مجال تربية الجزيئية لأصناف جديدة. وقد تخلفت التحليل الجيني على نطاق واسع وظيفية في القطن وراء معظم الأنواع النباتية الحديث ، على الأرجح بسبب حجمه كبير من الجينات الوراثية من الازدواجية وتعدد الصيغ الصبغية ، طويل دورة النمو والتحول الجيني لتمردات 1. لتسهيل سرعة وظيفية عالية الدراسة الجينية / الجينومية في القطن ، ونحن نحاول تطوير المقايسات عابرة سريعة وفعالة لتقييم وظائف الجينات القطن.
الفيروس المستحثة إسكات الجينات (VIGS) هي تقنية قوية التي تم تطويرها استنادا على المضيف بعد الترانسكربتي إسكات الجينات (PTGS) لقمع الانتشار الفيروسي 2،3. وقد الأجرعية بوساطة VIGS تطبيقها بنجاح في مجموعة واسعة من الأنواع مثل dicots الباذنجانية ، وأنواع البقول Arabidopsis ، والفلقة الأنواع بما في ذلك القمح والشعير والذرة ، لمختلف الدراسات الجينومية الوظيفية 3،4. حيث أن هذا النهج السريع والفعال يتجنب التحول النبات ويتغلب التكرار وظيفية ، ولا سيما انها جذابة ومناسبة للدراسة الجينوم الوظيفي في أنواع المحاصيل مثل القطن غير قابلة للتحول.
في هذه الدراسة ، فإننا تقرير مفصل لنظام بروتوكول VIGS الأجرعية بوساطة في القطن. بين النواقل الفيروسية VIGS عدة ، وسمع دوي فيروس التبغ (TRV) يغزو مجموعة واسعة من المضيفين وغير قادرة على الانتشار في جميع أنحاء بقوة كامل انتاج المصنع بعد أعراض خفيفة على hosts5. لرصد مدى كفاءة إسكات ، GrCLA1 ، وهو الجين homolog من Cloroplastos Arabidopsis alterados 1 الجين (AtCLA1) في القطن ، تم استنساخ وإدراجها في ناقلات ثنائية VIGS pYL156. CLA1 الجين يشارك في عملية التنمية بلاستيدات الخضراء 6 ، ودراسات سابقة قد أظهرت أن أدت الخسارة من وظيفة من AtCLA1 في النمط الظاهري على الأوراق البيضاء 7 صحيحا ، وتوفير علامة بصرية ممتازة لإسكات الكفاءة. في حوالي أسبوعين آخر الأجرعية تسلل ، بدأ النمط الظاهري البيضاء لتظهر على الأوراق الحقيقية ، مع إسكات كفاءة 100 ٪ في جميع التجارب منسوخة. وأكد أيضا على إسكات الجينات الذاتية التي كتبها RT - PCR التحليل. إلى حد كبير ، يمكن أن تحدث أكثر قدرة في إسكات جميع أصناف اختبرناها ، بما في ذلك مختلف أصناف تزرع تجاريا في تكساس. هذا الفحص السريع والفعال VIGS الأجرعية بوساطة يوفر أداة قوية جدا لتحليل واسع النطاق السريع وظائف الجينات في الجينوم واسعة في مستوى القطن.
Protocol
1. زراعة شتلات القطن
- بذر بذور القطن المرتفعات (الكرسف أزغب) Fibermax متنوعة 832 ، Phytogen 425RF ، 480WR Phytogen وDeltapine 90 في القدور (7 سم في القطر) التي تحتوي على مزيج مترو 700 (SunGR ، Beavile ، WA).
- الحفاظ على الأواني في صينية مغطاة بقبة بلاستيكية عند 23 درجة مئوية ، 120 متر μE -2 -1 S الخفيفة ، مع الإضاءة ساعة 12 ساعة light/12 مظلمة في غرفة النمو.
- إزالة القبة عند اثنين النبتات ظهرت.
- ما يقرب من اسبوعين في وقت لاحق ، واستخدام النباتات مع اثنين من النبتات موسعة كاملة عن مقايسة VIGS. في هذه المرحلة ، لم يترك الحقيقية ظهرت حتى الآن (الشكل 1).
2. بناء ناقلات تحمل VIGS GrCLA1 الجين
- تضخيم alterados Cloroplastos 1 الجين من القطن (GrCLA1) بواسطة PCR مع الاشعال GrCLA1 - F ، 5' - 3 - GCCCTTTGTGCATCTTC 'وGrCLA1 R - ، 5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3" من مكتبة [كدنا] ج. raimondii أنسجة نبات.
- هضم منتجات PCR من GrCLA1 مع EcoRI وKpnI وإدراجها في pYL156 (pTRV - RNA2) بواسطة ناقلات الربط.
- شاشة الحيوانات المستنسخة على لوحات أجار LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل من الكانامايسين. التحقق من بنيات بواسطة انزيم الهضم التقييد والتسلسل.
- تحويل البلازميد في الأجرعية المورمة GV3101 بواسطة electroporation والمتوسطة في استرداد LB السائل في 28 درجة مئوية. حدد transformants على لوحات مع LB + الكانامايسين (50 ميكروغرام / مل) + الجنتاميسين (25 ميكروغرام / مل). ويمكن تخزين هذه البكتيريا في الجلسرين 25 ٪ في -80 درجة مئوية لمدة الاستخدام على المدى الطويل.
3. أداء VIGS التلقيح
- قبل ثلاثة أيام متتالية الأسهم التلقيح ، الجلسرين المجمدة للالمورمة الأجرعية تحمل pYL192 (TRV) : RNA1 ، pYL156 (TRV) : RNA2 (ناقلات وحدها) وpYL156 (TRV) : RNA2 GrCLA1 - LB أغار على لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين و 25 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. احتضان لوحات على 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- قبل يومين من تسلل VIGS ، واختيار مستعمرة واحدة لكل من لوحات بناء أعلاه ، وتطعيم عليه في 5 مل من المتوسط LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين و 25 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ؛ تنمو ثقافة البكتيرية في 28 ° جيم ليلة وضحاها في طبلة الأسطوانة بسرعة 50 دورة في الدقيقة.
- نقل ثقافة أعلاه إلى دورق مع 50 مل من المتوسط LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين و 25 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ، بالاضافة الى 10 ملي زارة التربية والعلم (2 -- 4 (morpholino) - الإيثان حمض السلفونيك) و 20 ميكرومتر acetosyringone. تنمو ثقافة في 28 درجة مئوية لمدة ليلة في شاكر مع سرعة من 50 دورة في الدقيقة.
- في اليوم التالي ، وتدور باستمرار على الخلايا البكتيرية الزراعية في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، وإعادة تعليق الثقافة في المنطقة العازلة التي تحتوي على 10 ملي تسلل MgCl 2 و 10 و 200 ملي MES acetosyringone ميكرومتر. ضبط OD 600 من ثقافة إلى 1.5.
- ترك الثقافة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
- قبل تسلل Agrobacterial ، لكمة الجانب السفلي من النبتات من نباتات القطن بإبرة G 25 دون اختراق من خلال النبتات. واللكم واحد أو اثنين من الثقوب (يعتمد على ليونة الأنسجة) على كل مقطع من فلقة (الشكل 2).
- مزيج Agrobacterial تعليق ثقافة pYL192 (TRV) : RNA1 وpYL156 (TRV) : RNA2 أو pYL156 (TRV) : RNA2 - GrCLA1 في نسبة 1:1 ؛ ناحية التسلل الى خليط من الجانب السفلي من النبتات من خلال مواقع اصابة به (أ) 1 مل needleless حقنة (الشكل 3).
- تغطية النباتات بقبة بلاستيكية وترك النباتات تسللت في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف الضوء الخافت ليلة وضحاها.
- نقل النباتات إلى غرفة النمو مع درجة حرارة 23 درجة مئوية ، 120 متر μE ضوء -2 -1 S مع دورة 12 ساعة ساعة ضوء / 12 الظلام.
ملاحظة : عندما تعمل VIGS النباتات هي إما تحت 23 درجة مئوية أو البيوت الزجاجية (25-28 درجة مئوية). عندما تكون درجة الحرارة منخفضة نسبيا (23 إلى 25 درجة مئوية) ، فمن السهل على التلقيح والنمط الظاهري هو أكثر اتساقا بالمقارنة مع ارتفاع (28-30 درجة مئوية) أو درجة الحرارة تراوح. تغطي النباتات بقبة أيضا يجعل VIGS أكثر كفاءة.
- دراسة النمط الظاهري في إسكات 7 ~ 8 تسلل آخر أيام. بدأت RNA2 - GrCLA1 لعرض النمط الظاهري البيضاء (الشكل 4) : الأوراق الحقيقية للنباتات التي أسكتت pYL156 (TRV). محطات تسللت مع تحمل Agrobacteria pYL156 (TRV) : RNA2 بمثابة السيطرة.
- تحقق من كفاءة إسكات الجينات عن طريق فحص مستوى التعبير عن الجينات المحلية باستخدام تفاعل البلمرة عكس النسخ (RT - PCR) مع الجيش الملكي النيبالي معزولة عن السيطرة ونباتات القطن إسكاته.
ملاحظة : يجب وينبغي أن تظل النباتات VIGS افتتاحية تحت ظروف الحجر الصحي والنباتات الواردة تعقيمها بشكل سليم والتخلص منها بعد فحوصات TRV كما لديها مجموعة واسعة والمضيف هو الممرض الإبلاغ عنها.
4.ممثل النتائج :
بعد أسبوعين تقريبا من التسلل إلى جنب مع خليط Agrobacterial ، لوحظ بوضوح النمط الظاهري البيضاء التي تسببها GrCLA1 إسكات على الأوراق الحقيقية. إسكات كفاءة تصل إلى حوالي 100 ٪ في تجارب متعددة مع أكثر من 50 محطة. محطات إسكات عرض النمط الظاهري موزعة بشكل متجانس وقوي للغاية على تطوير البيضاء حديثا يترك مع فسيفساء على أوراق الاكبر (الشكل 4).
الشكل 1. الشتلة القطن في حوالي اسبوعين مع اثنين من المرحلة القديمة النبتات توسيع استخدامها لعمليات التسلل تماما Agrobacterial.
الشكل 2. الضرب وثقوب صغيرة في الجانب السفلي من النبتات من نباتات القطن باستخدام إبرة G 25 إلى تسهيل تسلل Agrobacterial.
الشكل 3. تسلل يد خليط Agrobacterial في النبتات من القطن خلال مواقع اصابة باستخدام حقنة needleless
الرقم 4 والذي بدا على النمط الظاهري ألبينو VIGS إسكات نباتات القطن. وتظهر أربعة أصناف. أ) Fibermax 832 ؛ ب) Phytogen 480WR ؛ C) Phytogen 425RF ؛ D) Deltapine 90.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ثبت VIGS أن تكون أداة قوية في مجال تحليل الجينوم الوظيفي عابر يطرق باستمرار التعبير عن الجينات المحلية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير VIGS الأجرعية بوساطة من خلال استخدام ناقل ثنائي TRV مقرا لها. وقد وضعت القطن CLA1 (GrCLA1) كعلامة الجينات البصرية لمراقبة كفاءة إسكات. لقد حصلنا على الدوام 100 ٪ من الكفاءة إسكات الجينات ، ويتجلى ذلك في النمط الظاهري البيضاء التي تظهر على الأوراق الحقيقية في جميع الأصناف المختبرة ، بدءا من حوالي اثنين تسلل آخر أسابيع. ومع ذلك ، CLA1 - إسكات نباتات القطن المتقدمة بالكاد في مرحلة الألياف أو البذور ، والتي هي على الأرجح بسبب عيوب قوية على التنمية بلاستيدات الخضراء. التطوير الناجح لVIGS القطن يوفر بديلا لإسكات جينات بسهولة الفائدة للخسارة وظيفة من المقايسات ويضع الأساس لعلم الوراثة وظيفية القطن / الجينوميات في عصر ما بعد الجينوم بسرعة تقترب من 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للالدكاترة. SP - دينيش كومار وليو لعيد ميلاد المسيح TRV - VIGS النواقل ، والدكاترة. تشوك Kenerley ، تيري ويلر ، وباير جيم ستار CropScience لتوفير بذور القطن. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني ليرة سورية والمعاهد الوطنية للصحة لPH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y.
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P.
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
