Summary
Wir präsentieren Ihnen die ausführlichen Protokoll für Agrobacterium-vermittelten Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Assay in Baumwolle. Der Tabak Rassel-Virus (TRV)-abgeleiteten Vektoren VIGS wurden eingesetzt, um RNA-Silencing von Baumwolle GrCLA1, Cloroplastos alterados 1-Gens zu induzieren. Der Albino-Phänotyp durch Schweigen GrCLA1 verursacht wurde am Keimlingsstadium innerhalb von 2 Wochen nach der Impfung beobachtet.
Abstract
Baumwolle (Gossypium hirsutum) ist eine der wichtigsten Kulturpflanzen weltweit. Erhebliche Anstrengungen wurden auf molekularer Züchtung neuer Sorten gemacht worden. Die groß angelegte Gen funktionelle Analyse in Baumwolle hat hinter den meisten der modernen Pflanzenarten, wahrscheinlich aufgrund seiner Größe von Genom, Gen-Duplikation und Polyploidie, lange Wachstumszyklus und Widerspenstigkeit zu genetischen Transformation 1 wurde zurückgeblieben. Zur Erleichterung der hohen Durchsatz funktionelle genetische / genomische Studie in Baumwolle, versuchen wir eine schnelle und effiziente transienten Assays zu entwickeln, um Baumwolle Genfunktionen zu beurteilen.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) ist eine mächtige Technik, basierend auf dem Host-post-transkriptionelle Gene Silencing (PTGS), um die Vermehrung der Viren 2,3 unterdrücken entwickelt wurde. Agrobacterium-vermittelte VIGS wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Dikotyledonen Arten wie Solanaceae, Arabidopsis und Leguminosen angewandt und Monokotyledonen Arten, darunter Gerste, Weizen und Mais, die aus verschiedenen funktionellen Genomik Studien 3,4. Da dies eine schnelle und effiziente Ansatz vermeidet Transformation von Pflanzen und überwindet funktionale Redundanz ist es besonders attraktiv und geeignet für funktionelle Genomik Studie in Nutzpflanzen wie Baumwolle nicht zugänglich für die Transformation.
In dieser Studie berichten wir über die detaillierte Protokoll der Agrobacterium-vermittelte VIGS System in Baumwolle. Unter den verschiedenen viralen Vektoren VIGS, dringt der Tabak Rassel-Virus (TRV) eine breite Palette von Hosts und ist in der Lage, kräftig ausgebreitet über den gesamten Anlagen noch produzieren milde Symptome auf der hosts5. Um die Wirksamkeit beim Verstummen, GrCLA1, ein Homologes Gen aus Arabidopsis Cloroplastos alterados 1-Gen (AtCLA1) in Baumwolle, wurde kloniert und in die VIGS Binärvektor pYL156. Cla1 Gen in Chloroplasten Entwicklung 6 beteiligt sind, und frühere Studien haben gezeigt, Monitor, loss-of-Funktion AtCLA1 führte zu einem Albino-Phänotyp auf Laubblätter 7, bietet eine exzellente visuelle Marker für silencing Effizienz. Bei etwa zwei Wochen nach Agrobacterium Infiltration begann die Albino-Phänotyp auf der Laubblätter erscheinen, mit 100% silencing Effizienz in allen wiederholten Experimenten. Das Schweigen der endogenen Genexpression wurde auch durch RT-PCR-Analyse bestätigt. Bezeichnenderweise konnte silencing potently in allen Sorten haben wir getestet, darunter verschiedene kommerziell angebauten Sorten in Texas auftreten. Diese schnelle und effiziente Agrobacterium-vermittelte VIGS Test liefert ein sehr mächtiges Werkzeug für die schnelle großflächige Analyse von Genfunktionen in Genom-weiten Ebene in Baumwolle.
Protocol
1. Wachsen Baumwolle Sämlinge
- Aussaat der Samen der Upland-Baumwolle (Gossypium hirsutum) Reihe Fibermax 832, PhytoGen 425RF, PhytoGen 480WR und Deltapine 90 in Töpfen (7 cm Durchmesser) mit Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Halten Sie die Töpfe in ein Tablett mit einer Plastikhaube abgedeckt bei 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 Licht, mit einer 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkelheit Photoperiode in einem Wachstumsmarkt Raum.
- Entfernen Sie die Kuppel, wenn zwei Keimblätter entstanden sind.
- Etwa zwei Wochen später, verwenden Sie die Pflanzen mit zwei voll entfalteten Keimblättern für VIGS Assay. In diesem Stadium haben die Laubblätter noch nicht entstanden (Abbildung 1).
2. Construct VIGS Vektor, der GrCLA1 Gen
- Amplify die Cloroplastos alterados 1-Gens aus Baumwolle (GrCLA1) durch PCR mit Primern GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'und GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' aus einer cDNA-Bibliothek von G. raimondii Blattgewebe.
- Digest der PCR-Produkte von GrCLA1 mit EcoRI und KpnI und insert into pYL156 (pTRV-RNA2) Vektor durch Ligation.
- Bildschirm die Klone auf LB-Agarplatten mit 50 pg / ml Kanamycin. Überprüfen Sie, ob die Konstrukte durch Restriktionsverdau und Sequenzierung.
- Transform das Plasmid in Agrobacterium tumefaciens GV3101 durch Elektroporation und erholen in LB-Flüssigmedium bei 28 ° C. Wählen Sie die Transformanten auf Platten mit LB + Kanamycin (50 ug / mL) + Gentamycin (25 ug / mL). Die Bakterien können in 25% Glycerin bei -80 ° C für die langfristige Nutzung gespeichert werden.
3. Führen VIGS Impfung
- Drei Tage vor der Inokulation, Streifen gefrorenen Glycerin Aktien von Agrobacterium tumefaciens Durchführung pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (Vektor allein) und pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 auf LB-Agarplatten mit 50 pg / ml Kanamycin und 25 pg / ml Gentamycin. Die Inkubation bei 28 ° C für 24 Stunden.
- Zwei Tage vor VIGS Infiltration, wählen Sie eine einzelne Kolonie für jedes Konstrukt aus den oben Platten und impfen sie in 5 ml LB-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin und 25 pg / ml Gentamycin ergänzt; wachsen die Bakterienkultur bei 28 ° C über Nacht in einer Bandage mit einer Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute.
- Übertragen Sie die oben genannten Kultur in einen Kolben mit 50 ml LB-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin und 25 pg / ml Gentamycin, plus 10 mM MES ergänzt (2 - (4 Morpholino)-ethansulfonsäure) und 20 uM Acetosyringon. Die Kultur bei 28 ° C über Nacht in einem Shaker mit einer Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute.
- Am folgenden Tag, Spin-down der Agrar-und Bakterienzellen bei 4000 rpm für 5 Minuten; resuspendieren die Kultur in die Infiltration Puffer mit 10 mM MgCl 2, 10 mM MES und 200 uM Acetosyringon. Passen Sie die OD 600 von der Kultur bis 1,5.
- Verlassen Sie die Kultur auf der Bank bei Raumtemperatur für 3 Stunden.
- Vor Agrobakterienkolonie Infiltration, Punsch der Unterseite der Keimblätter von Baumwollpflanzen mit einer 25 G Nadel ohne Piercing durch die Keimblätter. Ein oder zwei Löcher (abhängig von der Weichheit des Gewebes) wurden auf jedem Abschnitt des Keimblatt (Abbildung 2) gestanzt.
- Mix Agrobakterienkultur Aussetzung der pYL192 (TRV): RNA1 und pYL156 (TRV): RNA2 oder pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 im Verhältnis 1:1; Hand zu infiltrieren das Gemisch von der Unterseite der Keimblätter durch die Verwundung Websites mit einem 1 mL nadellose Spritze (Abb. 3).
- Decken Sie die Pflanzen mit einer Plastikhaube und lassen Sie den infiltrierten Pflanzen bei Raumtemperatur unter schwachem Licht Bedingung für die Übernachtung.
- Transfer-Anlagen zu einem Wachstum Raum mit einer Temperatur von 23 ° C, 120 uE m -2 s -1 Licht mit einem 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkel-Zyklus.
Hinweis: VIGS funktioniert, wenn Pflanzen entweder unter 23 ° C oder im Gewächshaus (25-28 ° C) sind. Wenn die Temperatur relativ niedrig (23 bis 25 ° C) ist, ist es einfacher für die Impfung und Phänotyp ist gleichmäßiger im Vergleich zu höheren (28-30 ° C) oder schwankten Temperatur. Abdecken der Pflanzen mit einer Kuppel macht auch VIGS effizienter.
- Untersuchen Sie das Schweigen Phänotyp bei 7 ~ 8 Tage nach der Infiltration. Die Laubblätter von Pflanzen zum Schweigen gebracht, indem pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 begonnen, die Albino-Phänotyp (Abb. 4) anzuzeigen. Die Pflanzen mit Agrobakterien Durchführung pYL156 (TRV) infiltriert: RNA2 als Kontrolle dienen.
- Überprüfen Sie die Gen-Silencing Effizienz durch die Untersuchung der Expression von endogenen Genen mittels Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) mit RNA aus Kontrolle und zum Schweigen gebracht Baumwolle Pflanzen isoliert.
Hinweis: Die VIGS-ed Pflanzen sollten unter Quarantäne enthaltenen Bedingungen und Pflanzen gehalten werden sollten ordnungsgemäß autoklaviert und entsorgt werden, nachdem die Tests als TRV hat ein breites Wirtsspektrum und ist eine meldepflichtige Erreger.
4.Repräsentative Ergebnisse:
Etwa zwei Wochen nach der Hand-Infiltration mit Agrobakterien Mischung wurde die Albino-Phänotyp durch GrCLA1 Schweigen verursacht deutlich auf der Laubblätter beobachtet. Das Schweigen Effizienz erreicht fast 100% in mehreren Experimenten mit mehr als 50 Pflanzen. Das Schweigen Pflanzen zeigen eine gleichmäßig verteilte und sehr stark Albino-Phänotyp auf neu entstehenden Blätter mit einem Mosaik auf den älteren Blättern (Abb. 4).
Abbildung 1. Ein Baumwoll-Sämling in etwa zwei Wochen alten Bühne mit zwei voll entfalteten Keimblättern für Agrobakterienkolonie Infiltration eingesetzt.
Abbildung 2. Punching winzige Löcher auf der Unterseite der Keimblätter von Baumwollpflanzen mit einer 25 G Nadel Agrobakterienkolonie Infiltration zu erleichtern.
Abbildung 3. Hand Infiltration von Agrobakterien Mischung in den Kotyledonen von Baumwolle durch die Verwundung Websites mithilfe einer Spritze ohne Nadel
Abbildung 4. Albino-Phänotyp erschien auf VIGS Schweigen Baumwollpflanzen. Vier Sorten werden gezeigt. A) Fibermax 832; B) PhytoGen 480WR; C) PhytoGen 425RF; D) Deltapine 90.
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Discussion
VIGS ist nachgewiesen worden, ein mächtiges Werkzeug in der funktionellen Genomanalyse werden durch transiente umzuwerfen der Expression endogener Gene. In dieser Studie entwickelten wir eine Agrobacterium-vermittelte VIGS durch die Verwendung eines TRV-basierten binären Vektor. Die Baumwolle Cla1 (GrCLA1)-Gen wurde als visuelle Marker entwickelt, um die Wirksamkeit beim Verstummen zu überwachen. Wir haben immer 100% der Gen-Silencing Effizienz, durch die Albino-Phänotyp, die auf der echten Blätter in allen Variationen getestet, ab etwa zwei Wochen nach der Infiltration zeigte erhalten. Allerdings Cla1-silenced Baumwollpflanzen kaum in die Faser oder Seed-Phase, die wahrscheinlich aufgrund der starken Defekte auf Chloroplasten-Entwicklung entwickelt. Die erfolgreiche Entwicklung der Baumwolle VIGS bietet eine Alternative zu leicht Schweigen der Gene von Interesse für die Loss-of-function-Assays und legt Grundstein für Baumwolle funktionelle Genetik / Genomforschung in die schnell näher rückende Post-Genom-Ära 8.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Drs. SP Dinesh Kumar-und Yule Liu für TRV-VIGS Vektoren und Drs. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr und Bayer CropScience für die Bereitstellung von Baumwollsamen. Diese Arbeit wurde von der NSF, um LS und NIH zur PH finanziert
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y.
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- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P.
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