Artículo de método

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

DOI:

10.3791/2969

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26 de octubre de 2011

 ,  ,  ,  , 
1Medical Research Council Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

En este artículo

Resumen

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Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Resumen

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A pesar de los avances en la toxicidad de modelado humano de los medicamentos, muchos de los compuestos no durante los ensayos clínicos debido a efectos secundarios imprevistos. El costo de los estudios clínicos son importantes, por lo tanto, es esencial que más pantallas toxicología predictiva se desarrollan y despliegan desde el principio en el desarrollo de fármacos (Greenhough et al 2010). Hepatocitos humanos representan el modelo de referencia actual estándar para evaluar la toxicidad del fármaco, pero son un recurso limitado que muestran la función variable. Por lo tanto, el uso de líneas de células inmortalizadas y en modelos animales de tejido se utilizan de forma sistemática debido a su abundancia. Aunque ambas fuentes son de carácter informativo, se ven limitadas por una mala función, variabilidad de las especies y / o la inestabilidad en la cultura (Dalgetty et al 2009). Las células madre pluripotentes (PSC) son una fuente atractiva alternativa de hepatocitos humanos, como las células (HLC) (Medine et al 2010). PSC son capaces de auto-renovación y diferenciación a todos los tipos de células somáticas en el adulto y representa por lo tantouna fuente potencialmente inagotable de células diferenciadas. Hemos desarrollado un procedimiento que es simple, altamente eficiente, susceptibles de automatización y el rendimiento funcional HLC humanos (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 y Hay et al 2011). Creemos que nuestra tecnología dará lugar a la producción escalable de HLC para el descubrimiento de fármacos, la modelización de enfermedades, la construcción de dispositivos extra-corporal y tratamientos basados ​​en la posible trasplante de células.

Protocolo

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1. Preparación inicial de todas las acciones químicas y utensilios de plástico de revestimiento de la cultura

Todas las medidas que se llevarán a cabo en una campana de cultivo de tejidos en condiciones asépticas.

  1. Preparación de factor humano de crecimiento de fibroblastos (hbFGF)
    1. Preparar solución al 10% de BSA en PBS y el filtro a través de un filtro de 0,22 micras.
    2. De la solución al 10% BSA preparar una solución de BSA al 0,2%.
    3. Añadir 10 ml de BSA al 0,2% hbFGF mg solution/100.
    4. Pre-humedezca un 0,22 micras filtro mediante el filtrado de 5 ml solución al 10% de BSA a través del filtro. Dese....

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Discusión

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Hemos desarrollado un modelo simple, homogéneo y altamente reproducible in vitro para generar niveles escalables de HLC humanos. Nuestro modelo ha sido validado por una serie de laboratorios colaboradores externos. Nosotros habitualmente caracterizan a las células madre derivadas HLC con nuestra caja de herramientas en la casa de las pautas del desarrollo y el hígado específicas ensayos funcionales (la mayoría de los cuales están disponibles en el mercado). Las etapas críticas en nuestro proceso son: el manteni.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Dr. Hay fue apoyado por una beca RCUK, el Dr. West fue apoyado por el Departamento de Cirugía, el Dr. Medine fue apoyado por una subvención del Fondo central BHF, el Sr. Baltasar-Lucendo Villarín fue apoyado por una Studenship MRC PhD. El Dr. Zhou fue apoyado por una beca del gobierno chino.

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Materiales

Matrigel placas de revestimiento y frascos

  1. Matrigel (10 ml, BD Biosciences, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  2. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  3. Placas de cultivo tisular (6 y 12 de bien, Corning, Reino Unido)
  4. Frasco de cultivo de tejidos (25 cm2 con ventilación, Corning, Reino Unido)

células madre de mantenimiento

  1. Medio fibroblastos de embriones de ratón acondicionado (MEF-CM) (100 ml, R & D Systems, EE.UU.), almacenar a -20 ° C.
  2. BSA solución (50 ml, Sigma Aldrich, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  3. Fibroblastos humanos básicos del factor de crecimiento (100 mg, Peprotech, EE.UU.), almacenar a -20 ° C.

HESCs pases con colagenasa

  1. Así confluentes o frasco de hESCs.
  2. Matrigel recubierto pozos o recipientes, según corresponda.
  3. Solución salina tamponada con fosfato (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), guárdelo a temperatura ambiente.
  4. Colagenasa IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  5. Medio fibroblastos de embriones de ratón acondicionado (MEF-CM) (100 ml, R & D Systems, EE.UU.).
  6. Factor humano de crecimiento de fibroblastos (100 mg, Peprotech, EE.UU.).

La diferenciación de hESCs a endodermo hepática

  1. RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  2. Suplemento B27 (10 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  3. Activina A (2 mg, Peprotech, EE.UU.), almacenar a -20 ° C.
  4. Recombinante Wnt3a ratón (2 mg, R & D Systems, EE.UU.), almacenar a -20 ° C.
  5. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  6. KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  7. No aminoácidos esenciales (100 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  8. β-mercaptoetanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, Reino Unido), guárdelo a temperatura ambiente
  10. Leibovitz L-15 del medio de cultivo (500 ml, Sigmuna Aldrich, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  11. Triptosa fosfato de caldo (100 ml, Sigma Aldrich, Reino Unido), se almacenan a 4 ° C.
  12. Fetal suero bovino, inactivado por calor (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  13. Hidrocortisona 21-hemisuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  14. La insulina (páncreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  15. L-glutamina (100 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  16. El ácido ascórbico (25 g, Sigma Aldrich, Reino Unido); almacenar a -20 ° C.
  17. HGF humano (10 mg, Peprotech, EE.UU.), almacenar a -20 ° C.
  18. Humana Recombinante oncostatina M (OSM) (50 mg, R & D Systems, EE.UU.), almacenar a -20 ° C.
  19. Jeringa unidad accionada por filtro de 0,22 micras (Millipore, Reino Unido)

Caracterización de las células madre derivadas endodermo hepática

Inmunotinción

  1. Tampón fosfato salino (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Reino Unido); stovolver a temperatura ambiente.
  2. PBST, PBS hizo con 0,1% de Tween 20 (Sigma-Aldrich, Reino Unido).
  3. Paraformaldehído (PFA) (Sigma-Aldrich, Reino Unido) se compone de PBS, tienda de -20 ° C.
  4. Glicerol (Sigma-Aldrich, Reino Unido), almacenar a temperatura ambiente.
  5. Tris base (Sigma-Aldrich, Reino Unido), almacenar a temperatura ambiente.
  6. Etanol
  7. Suero (ABD Serotech, Reino Unido), almacenar a -20 ° C.
  8. Anticuerpo secundario, fluoróforos Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, Reino Unido).
  9. Mowiol 4-88 (Polysciences Inc, EE.UU.) se compone de Tris HCL y glicerol como instrucciones de los fabricantes. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) se añade a la solución de Mowiol en una dilución 1:1000.
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpos primarios
Antígeno * Tipo Proveedor Dilución
ALB Monoclonal de ratón Sigma Aldrich 5.100
E-cadherina Monoclonal de ratón Millipore 1 / 100
α-fetoproteína Monoclonal de ratón Sigma 1 / 500
SSEA-4 FITC Monoclonal de ratón Biolegend 1 / 100
IgG Monoclonal de ratón Dako 1 / 500
Anticuerpos secundarios
Anti-ratón conjugado con FITC Monoclonales de cabra Invitrogen 1 / 400

Tabla 2. Los anticuerpos utilizados para células madre derivadas inmunotinción endodermo hepática, las concentraciones utilizadas, las especies desarrolladas en las empresas y la que se compra.

Análisis funcional del endodermo hepática y normalización (por mg de proteína)

Los ensayos del citocromo P450

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Juegos y luminómetro (Promega, EE.UU.).
  2. Blanco fondo plano placa de ensayo y 96 (BD Biosciences, Reino Unido).
  3. Kit de ensayo BCA (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Reino Unido).
  4. Transparente 96 y placa de ensayo (Iwaki, Reino Unido)

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D.

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