Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Crecimiento y preparación de inóculos bacterianos
- Descongelar las existencias de glicerol de Helicobacter pylori (H. pylori) o H. felis a -80 °C y subcultivo en placas de agar sangre de caballo (HBA) que comprenden: agar sangre base n.º 2 (véase la tabla de materiales); un "suplemento selectivo de antibióticos de Skirrow" modificado (compuesto por vancomicina, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL; trimetoprima, 5 μg/mL; anfotericina B, 2,5 μg/mL); y 5-10% (v/v) de sangre de caballo. Las bacterias crecen bien en condiciones microaeróbicas en frascos anaeróbicos de 2,5 o 3,5 L que contienen los paquetes de gas apropiados (ver Tabla de Materiales), a 37 °C.
NOTA: Las cepas de H. pylori cultivadas en estas condiciones deben subcultivarse después de 1 a 1,5 días de incubación, mientras que para H. felis, generalmente se requieren al menos 2 días de incubación. Los medios de cultivo y almacenamiento adecuados se han descrito en detalle anteriormente.
- Preparar inóculos bacterianos para la infección en ratones desde cultivos de fase logarítmica temprana a media. Coseche suavemente las bacterias de las placas de agar inundando cada placa con 1-2 ml de caldo de infusión cerebro-corazón (BHI). Suspensión: aspire de placas con pipetas Pasteur.
- Alternativamente, prepare inóculos de la bacteria Helicobacter que se han propagado en el caldo BHI durante 16-18 h. En este caso, recoja las bacterias mediante centrifugación a baja velocidad a 2.200 x g durante 10 min a 4 °C.
- Evaluar la viabilidad y la motilidad de las bacterias mediante el examen de preparaciones de montaje húmedo bajo microscopía de contraste de fase (objetivo 100X). Prepare las monturas húmedas resuspendiendo un asa llena de bacterias en una gota de 10-20 μL de caldo BHI en un portaobjetos de microscopio de vidrio. En el caso de H. felis, que es una bacteria mucho más grande que H. pylori, use un hemocitómetro para contar con precisión el número de bacterias viables. Confirme la pureza del cultivo realizando una tinción de Gram.
nota: Utilice solo inóculos de H. pylori si la mayoría de las bacterias tienen forma bacilar o espiral (la morfología puede variar según la cepa). Los inóculos de H. felis deben contener principalmente bacterias de forma helicoidal.No use inóculos si la mayoría de las bacterias tienen una morfología cocoide, ya que estas formas no son viables y no establecerán una infección en ratones.
- Estimar el número de bacterias en el inóculo contando bajo microscopía de contraste de fase el número aproximado de bacterias por campo (objetivo 100X) y utilizando la siguiente guía: 1 bacteria por campo = aproximadamente 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de Helicobacter/mL; 10 bacterias por campo = aproximadamente 107 UFC/mL; 100 bacterias por campo = aproximadamente 108 UFC/mL, etcetera.
- Cuando utilice un hemocitómetro, calcule las UFC/ml utilizando la siguiente fórmula:
UFC/mL = (número promedio de bacterias en un campo de 4 x 4) x (factor de dilución) x (104).
- Ajuste la densidad celular bacteriana del inóculo a aproximadamente 107-10 8 UFC/ml diluyéndola en caldo BHI, si es necesario.
- Para garantizar la máxima viabilidad bacteriana, utilice los inóculos para la sonda intragástrica lo antes posible después de la preparación.
- Siempre confirme la densidad y viabilidad de las células de H. pylori realizando un recuento viable de los inóculos inmediatamente después del procedimiento de sonda nasogástrica (ver más abajo). Esto no siempre es posible para H. felis, ya que no suele formar colonias aisladas en los medios de cultivo. El número de Helicobacters viables en los inóculos no puede determinarse únicamente mediante la medición de la densidad óptica (A600), ya que este método no discrimina entre bacterias viables (es decir, bacilares/espirales/helicoidales) y no viables (es decir, cocoides).
- Utilice los valores de densidad óptica como medio para estimar el número de bacterias H. pylori viables en los inóculos, pero en este caso, primero es necesario generar una curva de crecimiento. Para ello, los valores de A600 de los cultivos de H. pylori se monitorean a lo largo del tiempo y se correlacionan directamente con el número de bacterias viables, determinado por el recuento en placa.
nota: Un método conveniente para realizar tales determinaciones de la curva de crecimiento es cultivar bacterias en un medio líquido (Sección 1.2), utilizando matraces de cultivo de tejido de fondo plano estándar colocados en una incubadora de CO2 al 10%. A continuación, se compara el número de UFC, determinado a partir de las alícuotas de los cultivos obtenidos cada 4-6 h durante 2-3 días, con los valores correspondientes de A600. Es importante destacar que se deben generar curvas de crecimiento para cada cepa de H. pylori, ya que estas pueden crecer a diferentes ritmos y, además, no todas las cepas crecen bien con 10% deCO2.
>2. Por sonda intragástrica de ratones con Helicobacter
NOTA: Este método de sonda nasogástrica intragástrica se puede aplicar a otras especies bacterianas que colonizan el intestino, por ejemplo, S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Utilice ratones macho o hembra de 6 a 8 semanas de edad, libres de patógenos específicos (SPF) y Helicobacter. Utilice animales con antecedentes genéticos C57BL/6 para experimentos de infección con H. pylori o H. felis. En el presente estudio, utilizamos ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT) y modificados genéticamente que carecían de un receptor inmune innato clave (denominado animales knock-out o KO).
nota: Los ratones de otros antecedentes genéticos también se pueden usar para las infecciones por Helicobacter, sin embargo, los niveles de colonización y la gravedad de la enfermedad pueden verse afectados por el tipo de antecedentes del huésped.
- Aspire el inóculo bacteriano (Paso 1.5) en jeringas desechables de 1 mL y reemplace las agujas suministradas con agujas de calibre 23 en las que se colocan catéteres de polietileno desechables (longitud, 6-8 cm; diámetro interno, 0.58 mm). Fije los catéteres a las agujas mediante la aplicación de pequeñas tiras de película plástica (consulte la Tabla de materiales). Alternativamente, reemplace el conjunto de aguja/catéter mediante el uso de tubos de alimentación de plástico estériles (calibre 20 x 38 mm).
- Sujete físicamente a los ratones con un agarre firme en el pescuezo y la cola.
nota: Este procedimiento se puede realizar sin anestesia o, alternativamente, con el uso de un anestésico inhalado, como metoxiflurano o isoflurano.
- Inserte el catéter en el centro de la mandíbula abierta y guíelo en dirección caudal hacia el esófago. Extienda el cuello del ratón para permitir un fácil acceso al estómago a través del esófago (y lejos de la tráquea) hasta que la mayor parte o la totalidad del catéter ya no sea visible y se sienta resistencia, correspondiente a la base del estómago. Administrar una alícuota específica, generalmente 100 μL por inoculación (Figura 1).
nota: Los ratones deben ser alimentados con ≥ 105 UFC para garantizar una colonización óptima y la patología de la enfermedad.
