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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Síntesis SPIO-MtbsAb
- Sintetice 2,2'-(etilendioxi)bisetilamina (EDBE) conjugada con SPIO utilizando los métodos descritos anteriormente.
- Sintetizar anhídrido succinico SPIO-EDBE (SA).
- Agitar una solución alcalina (5 M de NaOH; 10 mL)) de SPIO-EDBE y SA (1 g; 10 μmol) a temperatura ambiente durante 24 h.
- Diálisar la solución con 20 cambios de 2 L de agua destilada utilizando un tubo de membrana porosa molecular (corte de 12.000-14.000 MW) y 6 h por cada cambio.
- Por último, añadir 100 μL de SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL de Fe) a 400 μL de 4,5 mg/mL de anticuerpo de superficie contra Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) para sintetizar SPIO-MtbsAb utilizando 1-hidroxibenzotriazol y (benzotriazol-1-iloxi) hexafluorofosfato de tripirrolidinofosfonio como catalizadores y agitar la solución a temperatura ambiente durante 24 h.
- Por último, separar las soluciones del anticuerpo no unido mediante cromatografía de filtración en gel.
- Cargue la mezcla de reacción (5 mL) en una columna de 2,5 cm × 33 cm y eluya con un tampón salino tamponado con fosfato (PBS). Confirme el complejo Ab-nanopartícula (es decir, nanosonda) utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico.
>2. Observación de la morfología de las partículas y medición del nivel de relajación
- Examine el tamaño promedio de las partículas, la morfología y la distribución del tamaño utilizando un microscopio electrónico de transmisión a un voltaje de 100 kV.
- Coloque la dispersión compuesta en una rejilla de cobre de malla 200 y séquela al aire a temperatura ambiente antes de cargarla en el microscopio.
- Mida los valores de tiempo de relajación (T1 y T2) de las nanosondas utilizando el relaxómetro de RMN a 20 MHz y 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Calibre el relaxómetro antes de cada medición.
- Registre los valores de r1 y r2 de los ocho puntos de datos generados a través de la inversión-recuperación y la secuencia de pulsos de Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivamente, para determinar las relajividades r1 y r2.
3. Imágenes celulares
- Cultive monocitos humanos THP-1 en RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovino, 50 μg/mL de sulfato de gentamicina, 100 unidades/mL de penicilina G sódica, 100 μg de sulfato de estreptomicina y 0,25 μg/mL de fungizona en una incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.
- Incubar nanosondas SPIO-MtbsAb (2 mM) con 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de Mycobacterium bovis BCG preincubadas con 1 × 107 monocitos activados en tubos de microcentrífuga (1 mL) en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 1 h.
- Centrifugar los tubos a 200 x g y desechar el sobrenadante. Vuelva a disolver los gránulos en el medio (200 μL).
- Escanee las muestras utilizando una secuencia de pulso de eco de gradiente rápido (Tiempo de repetición (TR) = 500; Tiempo de eco (TE) = 20; Ángulo de giro = 10°) a través de una resonancia magnética de 3.0-T para determinar la especificidad y sensibilidad de la nanosonda.
>4. Inoculación de BCG (Bacillus Calmette-Guérin)
- Reconstituya la vacuna liofilizada o el stock bacteriano en el medio de Sauton y luego diluya el stock con solución salina hasta que se disperse adecuadamente como se describió anteriormente.
- Inocular una cepa viva atenuada de M. bovis BCG, obtenida de ADIMMUNE (Taipei, Taiwán) (cepa de Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) a un volumen de 0,1 mL/ratón (es decir, 107 UFC) por vía intradérmica en la piel escapular dorsal izquierda o derecha de ratones, como se ha descrito anteriormente. Inyecte solución salina en ratones como control negativo. Monitoree a los animales diariamente después de la inoculación de BCG.
- Sacrificar animales 1 mes después de la inoculación de las bacterias mediante eutanasia con dióxido de carbono. Extraiga el tejido del sitio de inoculación intradérmica. Fije el tejido en formalina al 10% e insértelo en parafina para secciones seriadas a 5-10 μm. Teñir secciones de tejido con las tinciones de hematoxilina/eosina y Ziehl-Neelsen para las bacterias acidorresistentes y con azul de Berlín para el hierro férrico.
5. Resonancia magnética in vivo
- Inyecte ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea en ratones para anestesia animal.
- Inyecte sondas SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) en las venas de la cola de ratones. Imagen de resonancia magnética en ratones antes e inmediatamente después de la inyección de la sonda y luego cada 5 minutos durante 30 minutos para adquirir imágenes de espín rápido ponderadas en T2 (TR = 3000; TE = 90; campo de visión = 8).
- Analice cuantitativamente todas las imágenes de resonancia magnética utilizando la intensidad de la señal (SI), una medición de regiones definidas de interés en ubicaciones comparables de un centro de granuloma Mtb y el músculo de la espalda adyacente a un área granulomatosa.
- Calcule las mejoras relativas de la señal utilizando la medición del SI antes (SIpre; control) y 0-3 h después (SIpost) de la inyección de los agentes de contraste utilizando la fórmula
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
donde SIpre es el SI de la lesión en la exploración previa realzada y SIpost es el SI de la lesión en la exploración posterior realzada.