Se presentan dos independientes, basados en microscopio de herramientas para medir las deformaciones inducidas nuclear y del citoesqueleto en habitaciones individuales, que viven las células adherentes en respuesta a la aplicación de la tensión global o localizada. Estas técnicas se utilizan para determinar la rigidez nuclear (es decir, la deformabilidad) y para investigar la transmisión de fuerza intracelular entre el núcleo y el citoesqueleto.
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Artículo de método
Los ensayos biofísicos investigará las propiedades mecánicas del núcleo celular Interfase: Aplicación del sustrato deformación y manipulación de Microneedle
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Resumen
Resumen
En la mayoría de las células eucariotas, el núcleo es el más grande del orgánulo y es de 2 a 10 veces más rígido que el citoesqueleto de los alrededores y, en consecuencia, las propiedades físicas del núcleo de contribuir de manera significativa al comportamiento general de biomecánica de las células en condiciones fisiológicas y patológicas. Por ejemplo, en la migración de neutrófilos y la invasión de las células cancerosas, rigidez nuclear puede suponer un gran obstáculo en la extravasación o paso a través de espacios estrechos dentro de los tejidos. 1 Por otro lado, el núcleo de las células en el tejido mecánicamente activos como el músculo requiere un soporte estructural suficiente para soportar la tensión mecánica repetitiva. Es importante destacar que el núcleo está estrechamente integrado en la arquitectura celular, que está conectado físicamente con el citoesqueleto de los alrededores, que es un requisito crítico para el movimiento intracelular y la posición del núcleo, por ejemplo, en células polarizadas, los núcleos sinápticas en las uniones neuromusculares o en la migración de las células. 2 No es sorprendente que las mutaciones en proteínas de la envoltura nuclear, tales como laminas y nesprins, que juegan un papel crítico en la determinación de la rigidez nuclear y el acoplamiento núcleo-citoesqueleto, se ha demostrado recientemente para dar lugar a una serie de enfermedades humanas, incluyendo Emery- La distrofia muscular Dreifuss, la integridad física, distrofia muscular, y la miocardiopatía dilatada. 3 Para investigar la función biofísica de diversas proteínas de la envoltura nuclear y el efecto de mutaciones específicas, hemos desarrollado métodos experimentales para estudiar las propiedades físicas del núcleo de las células individuales, salón sometido a la perturbación mecánica global o localizada. La medición de deformaciones inducidas nuclear en respuesta a la solicitud aplicadas precisamente la tensión del sustrato proporciona información importante sobre la deformabilidad del núcleo y permite la comparación cuantitativa entre las diferentes mutaciones o líneas celulares deficientes de proteínas específicas de membrana nuclear. Aplicación localizada cepa del citoesqueleto con una microaguja se utiliza para complementar este ensayo, y puede proporcionar información adicional sobre la transmisión de la fuerza intracelular entre el núcleo y el citoesqueleto. El estudio de la mecánica nuclear en las células vivas intactas conserva la arquitectura intracelular normal y evita posibles artefactos que pueden surgir cuando se trabaja con núcleos aislados. Además, la aplicación del sustrato cepa presenta un buen modelo para el estrés fisiológico que experimentan las células en los músculos u otros tejidos (por ejemplo, células del músculo liso vascular expuesto a la cepa del barco). Por último, si bien estas herramientas han sido desarrolladas principalmente para estudiar mecánica nuclear, también se puede aplicar a investigar la función de las proteínas del citoesqueleto y la señalización mecanotransducción.
Protocolo
1. Substrato cepa
La medición de la tensión nuclear normalizado incluye la preparación de platos de presión con membranas transparentes, elástico de silicona como la superficie de cultivo de células, las células de revestimiento sobre la vajilla, y la adquisición de imágenes de las células antes, durante y después de la aplicación cepa (uniaxial o biaxial).
Preparación de platos membrana de silicona y la adhesión de las células
- Cada plato se compone de una cepa a medida plato de fondo de plástico con un diámetro de 3 "y un anillo de plástico para mantener una membrana de silicona, que sirve como sustra....
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Discusión
Sustrato de ensayo de tensión
Aplicación de la tensión se ha utilizado con éxito por nosotros y otros grupos para estudiar las deformaciones inducidas nuclear en las células sometidas a esfuerzos mecánicos y para investigar la contribución de determinadas proteínas de la envoltura nuclear a la rigidez nuclear. 4.8 La ventaja de esta técnica es que las sondas de las propiedades mecánicas de vida de los núcleos de su entorno celular normal y el citoesqueleto y que la aplicación de la t.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL082792 y NS059348 R01) y el Hospital Brigham and Cardiovascular Premio de Liderazgo Femenino Grupo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Fibronectina | Millipore | FC010 | |
| MitoTracker Red FM y FM Verde | Invitrogen | M22425 y M-7514 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Buffered Saline sal de Hank | Invitrogen | 14185 | |
| Fenol libre, DMEM | Invitrogen | 21063 | |
| De suero fetal bovino | Aleken Biológicos | FBSS500 | |
| Penicilina / estreptomicina | Sigma | P0781-100ML | |
| Vidrio borosilicato con filamento | Sutter Instrumento | BF100-78-10 | |
| Brillo / brillo no reforzado láminas de silicona, 0.005 " | Especialidad Manufacturing Inc. | ||
| Fosfato de Dulbecco solución salina tamponada | Invitrogen | 14200 | |
| 35 mm de vidrio platos fondo la cultura (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 | |
| Braycote 804 Grasa de vacío | SPI Supplies | 05133A-AB |
Referencias
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G.
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Reimpresiones y permisos
