NOTA: Se debe utilizar un vector de expresión de mamíferos adecuado para este protocolo. Aquí, se utiliza una sola construcción que contiene dos casetes de expresión (es decir, la expresión de cadena pesada y ligera es impulsada por promotores separados). Las cadenas pesadas y ligeras de trastuzumab se clonaron previamente en el vector. Este vector fue un regalo de Andrew Beavil, obtenido a través de un repositorio de plásmidos sin fines de lucro.
1. Recuperación y escalado de ADN vectorial
NOTA: El ADN vectorial se recibió como un cultivo de agar suave en la cepa Escherichia coli XL-1 Blue; el vector es portador de resistencia a la higromicina.
- Inserte una puñalada o asa de inoculación estéril en el agar blando del cultivo de puñaladas, luego raye una placa de agar Luria Bertani (LB) preparada con 75 μg/ml de higromicina para colonias aisladas. Incubar la placa a 37 °C durante 18-24 horas.
- Inocular una sola colonia en 5 ml de caldo Terrific (TB) que contiene 75 μg/ml de higromicina. Incubar el cultivo a 37 °C durante 18-24 horas con agitación a 225 rpm.
- Utilice el cultivo nocturno para preparar un stock de glicerol de ADN vectorial mezclando suavemente 800 μl de cultivo con 200 μl de glicerol al 80% en un criovial y congele a -80 °C.
- Añadir 100 μl del cultivo nocturno a 100 ml de TB que contengan 75 μg/ml de higromicina en un matraz agitador con deflectores (es decir, dilución de 1/1.000). Incubar el cultivo a 37 °C durante 18-24 horas con agitación a 225 rpm.
- Después del cultivo nocturno, extraiga y purifique el ácido nucleico (ADN) desoxirribosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de preparación midi/maxi con la siguiente excepción: durante el paso final, eluir o resuspender el ADN con agua (pH 7,0-8,5).
- Verifique la concentración y la pureza del ADN mediante lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm, luego almacene el ADN a -20 °C.
NOTA: Opcional (muy recomendable): Secuenciar el ADN utilizando cebadores específicos de vectores para confirmar la identidad.
>2. Transfección estable de células HEK-293
- Cultive y mantenga células HEK-293 (células de suspensión) de acuerdo con protocolos estándar en medios sin suero suplementados con surfactante no iónico al 0,1% en matraces Erlenmeyer. Mantener a 2 x 105 células/ml y subcultivo cada cuatro días. Cultivo de células a 37 °C con 5% de dióxido de carbono (CO2) y rotación de 120 rpm.
NOTA: Las células deben haber estado en cultivo durante no menos de 4 días y no más de 4 semanas antes de la transfección. Las células HEK-293 cultivadas como monocapas en medios que contienen suero también se pueden usar para este procedimiento.
- El día anterior a la transfección, siembre células HEK-293 a 3 x 105 células/ml en pocillos de una placa de 12 pocillos en 2 ml de Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor. El día de la transfección, compruebe que las células han alcanzado el 80-90% de confluencia
- Diluya el ADN y la polietilenimina (PEI) por separado en el medio de transfección y luego mézclelos.
- Diluir 1,25 μg de ADN vectorial por pocillo (15 μg para 12 pocillos) en medios de transfección de 300 μl. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Diluir 2,5 μl de 1 mg/ml de solución de PEI (30 μl para 12 pocillos, es decir, proporción 1:2 de ADN a PEI) en un medio de transfección de 300 μl. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Agregue el ADN diluido al PEI diluido, mezcle suavemente e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Agregue 50 μl de la mezcla de ADN/PEI gota a gota a cada pocillo de la placa. Agite la placa suavemente para distribuir la mezcla de transfección, luego coloque la placa a 37 °C, 5% CO2 durante 24 horas.
- Añadir 50 μg/ml de higromicina B por pocillo y devolver la placa a 37 °C, 5% CO2 durante 10 días.
NOTA: Para el día 10, las células no transfectadas habrán muerto y se habrán desprendido de la superficie de la placa, mientras que las células transfectadas de manera estable serán viables y se adherirán a la placa.
- Sustituya los medios de los pocillos por medios sin suero de 1/4 de volumen y DMEM de 3/4 de volumen complementados con FBS al 10 % (es decir, 0,5 ml de medios sin suero + 1,5 ml de DMEM = 7,5 % de concentración sérica final) e incube durante 4 días.
- Sustituya los medios de los pocillos por 1/2 volumen de medios sin suero y 1/2 volumen de DMEM suplementado con 10% de FBS (es decir, 1 ml de medios sin suero + 1 ml de DMEM = 5% de concentración sérica final) e incube durante 4 días.
- Sustituya los medios de los pocillos por medios sin suero de 3/4 de volumen y DMEM de 1/4 de volumen complementados con FBS al 10 % (es decir, 1,5 ml de medios sin suero + 0,5 ml de DMEM = 2,5 % de concentración sérica final) e incube durante 4 días.
- Sustituya el medio en los pocillos por 2 ml de medio sin suero suplementado con un 0,1% de tensioactivo no iónico (es decir, una concentración sérica final del 0%) e incube durante 4 días.
NOTA: Mantener una presión selectiva de 50 μg/ml de higromicina B sobre las células durante la adaptación sin suero. Las células adaptadas a medios libres de suero se desprenden de la superficie de los pocillos y pueden agruparse en suspensión. Consulte el paso 2.1 para conocer las condiciones de cultivo con el suplemento adicional de 50 μg/ml de higromicina B.
- Con una pipeta, mezcle suavemente los cultivos en suspensión en la placa de 12 pocillos y las celdas del pool en un tubo separado.
- Con un hemocitómetro, enumere las células agrupadas y la semilla en un medio sin suero de 30 ml en un matraz Erlenmeyer a 2 x 105 células/ml. Cultive las células a 37 °C con 5% de CO2 y rotación de 120 rpm. Subcultura y expandirse cada cuatro días.
- Continúe ampliando el tamaño del cultivo a la densidad celular requerida para obtener 10 viales a 1 x 107 células/vial para la criopreservación en nitrógeno líquido. Congele las células en medios libres de suero que contengan un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
NOTA: Los medios acondicionados que contienen anticuerpos se pueden recolectar en cada subcultivo para confirmar la producción de proteínas o se pueden usar para optimizar las condiciones de purificación. Para recolectar medios acondicionados y mantener las células para el subcultivo, centrifugue el cultivo a 300 x g durante 5 min, luego filtre-esterilice el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm. El sobrenadante filtrado puede mantenerse a 4 °C durante 1-2 semanas o a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo.
>3. Producción de anticuerpos a gran escala a partir de cultivos de sobrecrecimiento por lotes
NOTA: La producción de anticuerpos se puede seguir desde el paso 2.11, donde las células existentes se expanden a la densidad celular requerida en función del volumen de cultivo por lotes que se va a configurar. De lo contrario, las células que se han descongelado de la criopreservación comienzan en esta etapa una vez que se expanden a una densidad y volumen celular adecuados. Se pueden utilizar varios suplementos de cultivo para optimizar la producción de anticuerpos; En este protocolo se demuestra el uso de triptona para aumentar la producción de anticuerpos.
- Células de siembra a 2 x 105 células/ml en 100 ml de medios sin suero en dos matraces Erlenmeyer (para comparar los rendimientos de anticuerpos de cultivos no suplementados y suplementados con nutrientes). Cultivo a 37 °C, 5% CO2 y 120 rpm.
- Después de 24 horas, agregue triptona hasta una concentración final de 0.5% al cultivo suplementado con nutrientes. Iguale el volumen de la cultura no suplementada con medios sin suero.
- A partir del día 8, realice diariamente recuentos celulares de los cultivos utilizando un hemocitómetro para controlar la viabilidad celular. Coseche los sobrenadantes de cultivo una vez que la viabilidad celular sea inferior al 80%.
- Recolectar el sobrenadante por centrifugación de los cultivos a 3.000 x g durante 15 min, luego filtrar-esterilizar el sobrenadante (que contiene anticuerpo) a través de un filtro de 0,22 μm. Almacene los sobrenadantes a 4 °C (a corto plazo) o congele a -20 °C (a largo plazo).
