Análisis basado en citometría de flujo de la activación de células dendríticas mediante complejos inmunitarios

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>1. Aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos asociadas a tumores

1. En una campana de flujo laminar, extirpe los tumores de ratones sacrificados con CO₂ y coloque los tumores en medio RPMI sin suero fetal bovino (FBS).
   nota: Se recomienda encarecidamente afeitar a los ratones y rociarlos con etanol al 70% antes de extirpar los tumores para minimizar las posibles contaminaciones del pelaje. Asegúrese de que el tumor no supere los 25 a 40^mm2, ya que los tumores más grandes tienen menos células dendríticas (CD) que tienden a ser frágiles y propensas a sufrir la muerte celular. Si se necesita un mayor número de CD, a cada ratón se le pueden inyectar células tumorales en varios sitios.
2. Bajo una funda laminar estéril, corte los tumores en pedazos pequeños (aproximadamente 1 x 1 mm²) con unas tijeras quirúrgicas.
   1. Agregue todos los fragmentos tumorales de un ratón en un tubo estéril de fondo plano de 30 ml con barras de agitación magnéticas que contenga 5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS), 2 mg/ml de colagenasa IV y 0,01 mg/ml de DNasa I.
      cautela: Las células mieloides producen energía a través de la glicosilación, incluso en un estado estacionario. Por lo tanto, solo use medios que contengan glucosa (por ejemplo, HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) y Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)), ya que la inanición de glucosa durante tan solo 10 a 15 minutos provocará la muerte celular y la apoptosis dentro de las 24 horas. Use solo una colagenasa IV con baja endotoxina, ya que la colagenasa es producida por bacterias grampositivas (Clostridium histolyticum).
3. Agitar a unas 200 - 400 rpm en una incubadora de 37 ^oC con un agitador magnético durante 20-30 min.
4. Agregue 5 mL de medio completo y vuelva a suspender vigorosamente.
5. Filtre las células a través de un filtro de células de 70 μm. Centrifugar a 4 o C 400 rcf durante 5 ^-10 min para peletizar las células.
   cautela: No intente aislar las células directamente después de la digestión enzimática, ya que algunos tumores son necróticos y contienen cantidades relativamente grandes de restos celulares o matriz extracelular. Aplique las celdas en un medio de gradiente de densidad del 15% para obtener solo las celdas.
6. Suspenda 9 mL de medio de gradiente de densidad con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x para ajustar la osmolalidad y obtener una solución madre de Percoll al 100%. Mezcle 1,5 ml de solución madre de medio de gradiente de densidad con 8,5 ml de HBSS y mézclela vigorosamente con gránulos de células derivadas de tumores. Aplique suavemente 2 ml de DMEM en la parte superior de un medio con un gradiente de densidad del 15% y centrifugue a 400 rcf durante 20 minutos a temperatura ambiente. Deseche los sobrenadantes, ya que las células formarán una bolita en el fondo del tubo.
   1. Lave las células peletizadas dos veces volviéndolas a suspender en 10 mL de HBSS que contenga 2% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tampón de aislamiento), y centrifugar a 4 ^oC 400 rcf durante 5-10 min para granular las células.
   2. Cuente las células en un hemocitómetro usando azul de tripán bajo un microscopio óptico.
7. Vuelva a suspender 1 x 10⁸ células en un tampón de aislamiento de 1 mL e incube a 4 ^oC con 30 μL de perlas magnéticas conjugadas CD11b⁺ durante 15 min.
   PRECAUCIÓN: Evite el uso de perlas conjugadas con CD11c, ya que esto activará la DC e inducirá la muerte celular. No intente bloquear FcγRII y FcγRIII con anticuerpos anti-CD16/32. Los anticuerpos bloqueantes ligan FcγR, inducen una fuerte fosforilación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAP) y preparan la DC.
   1. Retire el exceso de perlas sueltas agregando 9 mL de tampón de aislamiento y celdas de centrífuga a 400 rcf durante 5 a 10 min a 4^oC.
8. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un tampón de aislamiento de 1 mL. Aplique las celdas en una columna magnética prelavada. Lave la columna dos veces con 3 mL de tampón de aislamiento.
   1. Retire la columna del imán. Pipetee 6 mL de tampón de aislamiento en la columna y enjuague las células marcadas magnéticamente en un tubo de recolección estéril empujando el émbolo. Centrifugar las celdas a 400 rcf durante 5 - 10 min a 4 ^oC.
   2. Vuelva a suspender las células a 100 μL por 1 x 10⁷ células y tiña con los siguientes anticuerpos conjugados con fluoróforos: Linage negativo (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI y Ly6G), MHCII, Ly-6C.
9. Clasifique las células por compuerta las células pequeñas, utilizando dispersión lateral (SSC) y dispersión directa (FSC), y cultive en un medio completo suplementado con 5 ng/mL GM-CSF: incube las células durante 1 hora a 37 ^oC para permitir que los macrófagos se adhieran a la placa. A continuación, transfiera las células sueltas y no adherentes a una nueva placa de cultivo.
   nota: El MoDC del ratón se define como CD11b⁺/CD11c⁺/MHCII^hi/Ly6C^lo/int. La expresión de Ly6C puede variar drásticamente entre los modelos tumorales y, en algunos modelos (por ejemplo, LMP), los MoDC carecen por completo de expresión de Ly6C. Un tumor³ B16F10 de 100 mm suele contener 5 x 10⁴ de CD, lo que da como resultado un total de aproximadamente 4 - 5 x 10⁶ células. De estas células, entre el 10 y el 15% son células inmunitarias y entre el 8 y el 10% son MoDC. El aumento de los números de CD se puede lograr inyectando ratones con tumores en múltiples sitios. Clasifique solo las células SSC/FCS pequeñas, ya que otras células mieloides pueden expresar marcadores como CD11c y Ly6C.
   opcional: Clasifique los monocitos infiltrantes del tumor como pequeñas células SSC/FSC que expresan Ly6C^hi y son negativas para MHCII. Posteriormente, se cultivaron monocitos in vitro con 50 ng/mL GM-CSF para obtener DC.

>2. Preparación de complejos inmunes tumorales-IgG

1. Cultivo de células tumorales en un matraz de cultivo de 75^cm2 hasta una confluencia del 70% en medios DMEM completos.
   1. Añadir 2 mL de tripsina/EDTA al 0,25% para separar las células del matraz de cultivo y monitorizar la morfología celular bajo un microscopio óptico para evitar la tripsinización excesiva.
   2. Añadir 8 mL de medio de cultivo completo (por 2 mL de tripsina) para inhibir la digestión de la tripsina, y centrifugar a 4 ^oC, 400 rcf durante 5-10 min para granular las células><. nota: Revise las células tumorales en busca de micoplasma utilizando un kit de PCR comercial. Prueba de bacterias gramnegativas y endotoxinas fúngicas mediante el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). El suero debe filtrarse a través de 0,22 μM y analizarse para detectar los virus del Código de Regulaciones Federales 9. Además, pruebe los medios de cultivo y los sueros dejando caer 100 - 200 μL en agar o caldo LB y cultive durante 2 días a 37 ^oC.
   3. Lavar de nuevo las células de tripsina y restos de suero volviéndolas a suspender en 10 mL de PBS y centrifugar a 400 rcf durante 5 a 10 min. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado 2 veces más.
2. Fije las células en paraformaldehído tamponado al 1,8% durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   1. Lave las células volviéndolas a suspender en 10 mL de PBS y centrifugar a 4 o C 400 rcf durante 5 ^-10 min.
   2. Aspire los sobrenadantes y repita el lavado dos veces más.
      opcional: Para los ensayos de absorción tumoral, las células se pueden marcar incubándolas durante 5 min a 37 ^oC en PBS que contiene 1 μM de éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE). A continuación, el CFSE se enfría con medios completos durante 10 min en hielo. Las células deben lavarse ampliamente en PBS que contenga un 2% de suero para eliminar el tinte residual.
3. Vuelva a suspender las células en tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (PBS suplementado con 2% de FCS + 5 mM de EDTA) y 0,5 μg/mL de anti-CD16/32 para bloquear las posibles interacciones proteína-proteína no específicas. Placa en forma de U de 96 pocillos/placa a una concentración de 1 x 10⁵ células por 100 μL.
   1. Agregue diferentes diluciones de anticuerpos que se unen a tumores que van desde 5 μg - 5 ng/1 x 10⁵ células. Incubar la placa en hielo durante 15-20 min.
      nota: Los anticuerpos IgG se aislaron del suero de ratones hembra naïve de 20-24 semanas de edad en columnas de proteína A, como se describe.
4. Lave las células añadiendo 150 μL de PBS y centrifugando la placa a 4 o C 400 rcf durante 5 ^-10 min.
   1. Deseche los sobrenadantes y repita el lavado dos veces. Vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón FACS que contiene un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos. Placa de incubación en hielo durante 20 min.
   2. Lave las células añadiendo 200 μL de tampón FACS y centrifugando la placa a 400 rcf durante 5 - 10 min. Deseche los sobrenadantes y repita el lavado.
   3. Analice la unión tumoral mediante citometría de flujo y determine la concentración mínima requerida para recubrir las células.
      nota: Los anticuerpos que no aumentan la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células tumorales teñidas al menos cinco veces con respecto al control del isotipo no se deben utilizar en ensayos funcionales posteriores.

>3. Activación de MoDC con Tumor-IgG IC

1. Recubrir las células tumorales con una concentración mínima de IgG, como se describe en las secciones 2.1 a 2.4.3
   1. Un día antes de activar MoDC con IC tumoral, reemplace los medios de cultivo de MoDC que contengan GM-CSF. Para ello, aspire suavemente el medio y lave las células una vez con un medio de cultivo completo precalentado.
      nota: Las MoDC aisladas asociadas a tumores maduros deben cultivarse durante al menos 2 a 3 h (o incluso toda la noche) después de la clasificación en medios completos sin GM-CSF y antes de activarlas con IC.
   2. Para los análisis de captación tumoral, agregue el IC tumoral marcado con CFSE a MoDC en una proporción de 1:5 (IC: MoDC) e incube durante la noche durante 12 a 16 h en 1 mL de medio completo por 1 x 10⁶ DC.
   3. Para los análisis FACS de los experimentos de activación de MoDC, agregue tumor-IC en una proporción de 1:1 (IC: MoDC) e incube durante la noche durante 12 a 16 h.
      nota: Es muy recomendable incluir un pozo de control positivo, en el que se estimulan las MoDC con 1 μg/mL de LPS u otros agonistas de TLR.
   4. Después de la activación durante la noche, aspire los sobrenadantes y lave las células suavemente tres veces con tampón de aislamiento o 10 mM EDTA HBSS.
   5. Para separar la DC de la placa, incube las células durante 2 a 3 minutos en HBSS de 1 mL que contenga 10 mM de EDTA y separe las células mediante pipeteo vigoroso.
   6. Centrifugar las celdas a 400 rcf y volver a suspender 1 x 10⁶ DC en 90 μL de PBS suplementado con FCS al 2%, 5 mM de EDTA (tampón FACS) y 0,5 μg de anticuerpos bloqueantes. Incubar en hielo durante 5 a 10 min.
   7. Añadir 10 μL de mezcla de anticuerpos para teñir las células e incubar en hielo durante 15 min.
   8. Agregue 2 mL de tampón FACS a las celdas y centrifugue a 4 o C 400 rcf durante 5 ^-10 min.
2. Vuelva a suspender las células en tampón FACS de 200 μL.
   1. Añada de 0,5 a 1 μg/ml de DAPI de 1 a 2 minutos antes de analizar las muestras para excluir las células muertas de los análisis. No incube en exceso DAPI, ya que MoDC lo absorberá en 10 a 15 minutos.