Se describen los procedimientos para la administración repetida de los inhibidores de la señalización de receptores muscarínicos a la largo del músculo elevador del auris (LAL) del músculo de los ratones adultos jóvenes y de inmunotinción posterior de sus uniones neuromusculares (NMJs) en wholemounts. El músculo LAL tiene ventajas únicas para revelar In vivo Efectos farmacológicos en NMJs.
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Artículo de método
La administración subcutánea de antagonistas muscarínicos y Triple-inmunotinción del músculo largo del elevador del Auris en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Los músculos de las extremidades traseras de los roedores, tales como gemelos y el músculo tibial anterior, se utilizan con frecuencia en los estudios farmacológicos in vivo de las señales esenciales para la formación y el mantenimiento de NMJs mamíferos. Sin embargo, la penetración del fármaco en estos músculos después de la administración subcutánea o intramuscular es a menudo incompleta o irregular y muchas NMJs puede quedar afectada. Aunque la administración sistémica con dispositivos tales como mini-bombas se pueden mejorar los efectos espacio-temporales, la naturaleza invasiva de este método puede causar confusión respuestas inflamatorias y / o daño muscular directo. Además, el análisis completo de la NMJs en un músculo extremidades posteriores es un reto porque requiere mucho tiempo de seccionamiento de serie y la inmunotinción extensa.
La LAL del ratón es una hoja delgada y plana de músculo que se encuentra superficialmente en el dorso del cuello. Es un músculo de contracción rápida que funciona para mover el pabellón de la oreja. Que contiene partes rostral y caudal que se originan en la línea media del cráneo y se extienden lateralmente a la porción cartilaginosa de cada pabellón. El músculo está inervado por una rama del nervio facial que los proyectos de caudal a medida que sale del agujero estilomastoideo. Nosotros y otros han encontrado LAL a ser una preparación útil que ofrece ventajas para la investigación de corto y largo plazo los efectos in vivo de las drogas en NMJs y los músculos. En primer lugar, su localización superficial facilita múltiples aplicaciones locales de medicamentos bajo anestesia ligera. En segundo lugar, su delgadez (2-3 capas de las fibras musculares) permite la visualización y el análisis de casi todos los NMJs dentro del músculo. En tercer lugar, la facilidad de disección con su nervio intacto, junto con el patrón de su inervación permite el análisis complementario electrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, y quizás lo más importante, una pequeña cantidad aplicada (~ 50μl) fácilmente cubre la superficie del músculo entero, ofrece una exposición uniforme y prolongada de todas sus NMJs a la droga y elimina la necesidad de un enfoque sistémico 1,8.
Protocolo
1. La administración subcutánea de receptor de acetilcolina muscarínicos (mAChR) antagonistas
- Preparar en condiciones asépticas, la dosis apropiada de antagonista mAChR, (cf. cuadro) mediante la disolución del fármaco en solución salina fisiológica estéril en el tubo de reacción de 1,5 ml. Los antagonistas se utilizaron los siguientes: atropina, methoctramina, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- Dibuja 50μl de solución en jeringa de insulina a1cc y usar una jeringa para cada ratón. También preparan las jeringas que contienen solución salina fisiológica única para cada ratón en el grupo control. Mantenga las jeringas en el hielo hasta que esté listo....
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Discusión
El método aquí presentado permite la investigación de los roles previamente no reconocido de los subtipos específicos mAChR de señalización en la estabilidad y el mantenimiento de NMJs mamíferos. Este método también será útil para probar los efectos de los factores neurotróficos y agentes farmacológicos. Por ejemplo, nuestro laboratorio encontró que el factor neurotrófico ciliar (CNTF) provocó brotes de casi todas las terminales nerviosas en ratones adultos LAL 1 . Este resultado contrasta con estudios previos de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Distrofia Muscular, el NIH (NS062320).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| la ketamina | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dosis: 120mg/kg |
| xilazina | Lloyd Laboratorios | LA33806 | Dosis: 8mg/kg |
| atropina | Sigma-Aldrich | A0132 | (Pureza> 98%); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg |
| atropina | Voigt de distribución global | AT105 | De calidad farmacéutica |
| Methoctramina | Sigma-Aldrich | M105 | Dosis: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dosis: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Bioscience Tocris | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Bioscience Tocris | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Péptidos Internacional | PMT-4340-s | 0,1 M - 1M |
| 1X buffer fosfato pH de solución salina, 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehído | Pescador | T353-500 | Haz solución al 10% por primera vez por la disolución 10g/100mL desionizada agua destilada; hacer 4% con 1X PBS, ajustar el pH a 7.4 |
| Sodio pentobarbitol | Virbac Salud Animal | NDC-051311-050-01 | Dosis: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Parte # 184 | Siga las instrucciones que vienen con el kit, puede utilizar múltiples cultura plato de tamaño mediano (30mm, 60mm, 100mm) en función de las necesidades |
| 0,1 M de glicina | Sigma-Aldrich | G-7126 | Añadir 0.185g a 25 ml de 2% de BSA / PBS |
| 2% de albúmina de suero bovino (BSA al 2%) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Disolver 2 g de BSA en 100 ml de PBS 1X |
| 0,2% Triton X100 en el 2% BSA / PBS (tampón de bloqueo) | Sigma-Aldrich | T9284-100 ml | Disolver 0.2ml/100mL 2% de BSA / PBS |
| α-bungarotoxina | Invitrogen | T1175 | Uso a una concentración de 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger anticuerpos monoclonales | SMI312 | Uso a una concentración de 1:1000 |
| SV2 | Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma | SV2-Sobrenadante | Uso a una concentración de 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Uso a una concentración de 1:400 |
| FITC cabra anti-ratón IgG1 | Roche | 03117731001 | Uso a una concentración de 1:200, pero si el fondo es alto, trate de 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugado de cabra anti-conejo | Invitrogen | A21244 | Uso a una concentración de 1:200 |
| Vectashield fluorescentes montaje de media | Vector de laboratorios | H-1000 | Esto no es un medio de comunicación en un apuro, tendrá que asegurar la hoja de la cubierta con esmalte de uñas transparente. |
| Tijeras pequeñas de Primavera | Herramientas de Bellas Ciencia | 15002-08 | |
| Pinzas de disección | Herramientas de Bellas Ciencia | 11295-51 |
Referencias
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y.
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Reimpresiones y permisos
