Un In vivo Imágenes de protocolo para monitor principal axones sensoriales después de aplastar a la raíz dorsal se describe. Utilizar los procedimientos de campo amplio microscopía de fluorescencia y thy1-YFP ratones transgénicos, y permitir imágenes repetidas de la regeneración de axones más de 4 cm en el SNP y la interacción axón con la interfaz del sistema nervioso central.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía
En este artículo
Resumen
Resumen
Los axones sensoriales primarias heridos por lesiones raíz espinal no se regeneran en la médula espinal, causando dolor crónico y pérdida sensorial permanente. La regeneración de la raíz dorsal (DR) los axones en la médula espinal se previene en la zona de la raíz dorsal de entrada (DREZ), la interfaz entre el SNC y SNP. Nuestra comprensión de los eventos moleculares y celulares que impiden la regeneración en DREZ es incompleta, en parte debido a los cambios complejos asociados con la lesión del nervio se han deducido del análisis post-mortem. Dinámica de procesos celulares, tales como la regeneración axonal, se estudia mejor con las técnicas que la captura de eventos en tiempo real con múltiples observaciones de cada animal vivo. Nuestra capacidad para controlar las neuronas en serie en vivo ha aumentado dramáticamente debido a las innovaciones revolucionarias en la óptica y los transgénicos de ratón. Varias líneas de thy1-GFP ratones transgénicos, en el que los subgrupos de neuronas son genéticamente etiquetados en distintos colores fluorescentes, permiten las neuronas individuales para ser captado en vivo 1. Estos ratones se han utilizado ampliamente para imágenes in vivo de los músculos y el cerebro 2-4 5-7, y han proporcionado nuevos conocimientos sobre los mecanismos fisiológicos que los análisis estáticos no se podría haber resuelto. Los estudios de imágenes de las neuronas en la médula espinal que viven sólo recientemente han comenzado. Lichtman y sus colegas han demostrado su viabilidad mediante el seguimiento de heridos columna dorsal (DC), los axones con un amplio campo de la microscopía 8,9. Multi-fotón de imágenes in vivo de la profunda posición axones DC, microglia y los vasos sanguíneos también se ha logrado 10. En los últimos años, hemos sido pioneros en la aplicación de imágenes in vivo para controlar la regeneración de los axones DR con amplio campo de la microscopía y la línea H de thy1-YFP ratones. Estos estudios nos han llevado a una nueva hipótesis acerca de por qué los axones DR se les impide la regeneración de la médula espinal 11.
En la línea H de thy1-YFP ratones, distintas YFP + axones son superficialmente posición, que permite a varios axones a ser monitoreados simultáneamente. Hemos aprendido que los axones DR llegar a DREZ son mejores imágenes en el lumbar que en la médula espinal cervical. En el presente informe se describen varias estrategias que nos han sido útiles para asegurar imágenes de éxito a largo plazo y de la regeneración de los axones repetidas DR. Estos incluyen métodos que eliminan la intubación y la interrupción de las vías respiratorias repetidas, minimizar la cirugía asociada con el estrés y la formación de cicatrices, y obtener imágenes estables en alta resolución sin fototoxicidad.
Protocolo
1. Microscopio de configurar y preparación de imágenes
- Nuestra imagen creada se compone de un microscopio estereoscópico Leica MZ16 fluorescentes con una velocidad de obturación rápida y una cámara CCD enfriado controlado por el software Metamorph.
- Prepare una almohadilla térmica de temperatura controlada y ajustar la producción a 32,5 ° C para mantener la temperatura corporal del animal durante y después de la cirugía.
- Ringer tibia estéril la solución o líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) a 32,5 ° C de antemano para el riego de la médula espinal durante la cirugía.
- Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
DR regeneración de imagen directamente en ratones vivos es particularmente difícil porque requiere una laminectomía dorsal sustancial para controlar el crecimiento del axón en una amplia zona seguido por múltiples procedimientos invasivos quirúrgicos y anestésicos en las sesiones de formación de imágenes posteriores. Las estrategias que han contribuido a superar estos retos. Imágenes en primer lugar, el éxito requiere la reducción de la mortalidad del ratón (aproximadamente el 25%), reduciendo al mínimo la duración de l.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Alan Tessler por sus comentarios y ayuda editorial. Este trabajo fue apoyado por el NIH NS062320.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| H línea thy1-YFP (2-4 meses de edad, ambos sexos) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xilazina (inyección AnaSed, solución estéril) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg / kg |
| La ketamina (inyección de clorhidrato de ketamina, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg / kg |
| La buprenorfina (inyectable Buprenex) (0,05 mg / kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. (Richmond, VA) | 7571 | |
| Pequeñas máquinas de cortar el pelo de animales | Oster Profesional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Loción capilar eliminación | Church & Dwight Co. (Princeton, NJ) | NAIR con aceite para bebé | |
| Gasas | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Con puntas de algodón | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14 a 960-3T | |
| Jeringas de 1 ml | Becton, Dickinson y Compañía Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutánea (Sub-Q) agujas, 26ga. | Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Tijeras y pinzas de primavera | Herramientas de Bellas Ciencia, (Foster City, CA) | ||
| 2,5 mm gubia curva | Herramientas de Bellas Ciencia, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactato de Ringer USP Inyección | B. Braun Medical Inc. (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Solución salina estéril | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Membrana delgada matriz sintética (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, Virginia Occidental) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Impedir MVP sustituto Dura, WL Gore & Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 suturas de seda | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Clips de la herida | Perfecto - Ets Bruneau, (Burnea, Francia) | A75 | |
| Estereoscópico fluorescente | Leica Microsystems, (Wetzlar, Alemania) | MZ16 | |
| CCD de la cámara | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Controlador de temperatura | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
Referencias
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
