Relaciones morfológicas escala capturar y describir la forma del organismo. Se presenta un método para medir las relaciones morfológicas de escala a través del área de distribución natural de los tamaños de cuerpo de los insectos totalmente metamórficas. Utilizando una sencilla manipulación de la dieta se aumenta la distribución de tamaños de característica, que permite la descripción exacta de cómo la forma y el tamaño de co-varían.
Artículo de método
La manipulación experimental del tamaño del cuerpo para la estimación de las relaciones morfológicas de escala en Drosophila
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Resumen
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La escala de las partes del cuerpo es una característica central de la morfología de los animales 7.1. Dentro de las especies, las características morfológicas deben ser correctamente proporcionada al cuerpo para que el organismo funcione, las personas mayores suelen tener más partes del cuerpo y los individuos más pequeños por lo general más pequeñas partes del cuerpo, de tal manera que la forma del cuerpo en general se mantiene en un rango de tamaños de cuerpo de un adulto. El requisito de que las proporciones correctas significa que los individuos dentro de cada especie por lo general presentan poca variación en el tamaño de carácter familiar. En contraste, el tamaño de rasgo familiar puede variar enormemente entre las especies y es un mecanismo principal por el cual se produce la diversidad morfológica. Más de un siglo de trabajo comparativo ha establecido estas intra e interespecíficas patrones de 3,4.
Quizás el método más ampliamente utilizado para describir esta variación es calcular la relación de escala entre el tamaño de dos rasgos morfológicos mediante la ecuación alométrica y = bxα, donde x e y son del tamaño de los dos rasgos, como el órgano y el tamaño corporal 8 , 9. Esta ecuación describe la intra-grupo (por ejemplo, las especies, la población) relación de escala entre los dos rasgos que ambos varían en tamaño. Transformación logarítmica de esta ecuación produce una simple ecuación lineal, log (y) = log (b) + αlog (x) y log-log parcelas del tamaño de los rasgos diferentes entre los individuos de la misma especie suelen revelar la escala lineal con un intercepto de log (b) y una pendiente de α, denominado "coeficiente alométrico" 9,10. La variación morfológica entre los grupos se describe por las diferencias en intercepta relación de escala o pistas para un par determinado rasgo. En consecuencia, la variación en los parámetros de la ecuación alométrica (b y α) elegantemente describe la variación de la forma capturado en la relación entre el órgano y el tamaño del cuerpo dentro y entre los grupos biológicos (ver 11,12).
No todos los rasgos de escala linealmente entre sí o con el tamaño del cuerpo (por ejemplo, 13,14) Por lo tanto, las relaciones morfológicas de escala son más informativos que los datos son tomados de la amplia gama de tamaños de rasgo. Aquí se describe cómo una simple manipulación experimental de la dieta puede ser utilizada para producir toda la gama del tamaño del cuerpo de los insectos. Esto permite una estimación de la relación de escala completa de dos determinados rasgos, lo que permite una descripción completa de la forma cómo covaría con un tamaño y una comparación robusta de los parámetros de relación de escala entre los grupos biológicos. Aunque nos centramos en Drosophila, la metodología debe ser aplicable a casi cualquier insecto totalmente metamórficas.
Protocolo
1. Crianza y manipulación de la dieta para producir una variación en el tamaño corporal y el tamaño del ala
Racional y general. La expresión de las relaciones de escala en última instancia depende de los procesos de desarrollo normativo que producen variación en el órgano final y el tamaño del cuerpo. Estos procesos se describen mejor en el trabajo de insectos totalmente metamórficas (es decir, holometábolos), como D. melanogaster, donde los órganos crecer como indiferenciada "discos imaginales" en el grub-como larva 11,15-17. En Drosophila, el órgano final y el tamaño del cuerpo son regulados por el crecimiento durante la fase larvaria, las larvas crecen a través del estadio larval primera y la segunda hasta que alcancen un peso mínimo viable para la eclosión (MVW E) hacia el comienzo del tercer estadio larval de 18 años. Hambre antes de alcanzar MVW E impide la eclosión de adultos. Sin embargo, las larvas que están muertos de hambre en MVW E generar adultos viable, aunque a un tamaño muy pequeño. Esto se debe a reducción de la nutrición durante el desarrollo del cuerpo reduce el final y el tamaño del órgano, no sólo en las moscas, pero en casi todos los animales 19-21. Mediante la manipulación de la disponibilidad de alimentos después de MVW E se alcanza, pero antes de la pupación ocurre, es posible inducir la extrema plasticidad fenotípica en el tamaño corporal que es mucho más importante otras fuentes de variación (por ejemplo, la variación genética individual).
- Los huevos son recogidos de la población a ser fenotipo, dividido en lotes de 50 y se colocan en frascos que contienen 10 ml de alimentos marcha estándar. Debido a la oviposición ocurre continuamente, los huevos se recogen cada 24 horas durante tres días, la producción de tres grupos de edad.
- Cuando la cohorte de más edad llega a la etapa errante o acaba de empezar para pupar, la manipulación de la dieta se aplica. En este punto, la cohorte de más edad es mucho más allá de la E MVW, la cohorte más joven está muy cerca de la E MVW y la cohorte restante está en algún lugar entre estos extremos. Por lo tanto, la eliminación de alimentos en este momento se producen los adultos de gran tamaño de la cohorte de más edad, los adultos muy pequeños de la cohorte más joven y los adultos de tamaño intermedio de la cohorte restante. Para eliminar las larvas de los viales, de aproximadamente 5 ml de solución de sacarosa al 40% se agrega a todos los viales. Para liberar a las larvas, los alimentos se agita durante 15-20 minutos sobre una mesa vibradora conjunto a una velocidad intermedia.
- Las larvas flotantes se eliminan de la solución de sacarosa con una multa (00) pincel, se colocan en frascos que contienen un tapón de algodón mojado y se permite que se convierten en crisálidas. Por otra parte, las larvas pueden ser colocados sobre un aditivo alimentario no digerible como metilcelulosa 22.
2. Estimación del tamaño corporal
Racional y general. Estudios previos indican que la longitud del tórax es una representación menor que el tamaño ideal para el total del cuerpo 22. En su lugar, utilizar el tamaño de pupa como una medida del tamaño del cuerpo. Tamaño corporal máximo se fija en el cese de la alimentación que precede a la fase de pupa. Como resultado, existe una estrecha correlación entre el tamaño de las pupas y el tamaño corporal adulto de 23.
- Las pupas están dispuestas lado ventral hacia arriba en el portaobjetos de vidrio y fotografiado con una cámara digital conectada a un microscopio de disección. Cada imagen es capturada, le asigna un código de identificación único y transferir al ordenador a través de una transmisión en vivo de conectar la cámara digital a la computadora.
- Imágenes pupas se mueven al individuo 2 ml que contiene 1 ml epitubes de alimentos volar, etiquetados con el código único para ese individuo, y se punza con respiraderos para permitir el intercambio de gases.
- Tamaño de las pupas se estima como el número de píxeles de la silueta de pupa. Otros indicadores de tamaño también puede ser utilizado.
3. Rasgo (ala) estimación del tamaño
Racional y general. A las alas de la imagen, se utiliza un ala de grabber "24, que atrae y mantiene el ala de un perpendicular vivir, volar anestesiado a su cuerpo. Presionado entre dos piezas de vidrio, esto permite que el ala para ser captado como un objeto de dos dimensiones.
- Las moscas son anestesiados con un poco de CO 2 y se coloca en la posición de la pinza de mariposa en un microscopio de disección provisto de una cámara digital que se conecta a un ordenador.
- El ala se crea una imagen y se guarda bajo el código único para cada individuo.
- Tamaño de las alas se puede calcular utilizando el polígono convexo mínimo que circunscribe marginal referencias fijas o como el número de píxeles de la silueta de las alas.
4. Escala de estimación relación
- Los datos se agrupan en las cohortes, pero separados por sexo y transformación logarítmica.
- Relaciones de escala se ajuste a los datos de tamaño con el Tipo II (es decir, el eje mayor reducido) de regresión (ver revisión en 12) y los parámetros estimados para cada grupo.
5. Los resultados representativos:
tienda de campaña "> Nuestros manipulación de la dieta se produce una amplia gama de tamaños de cuerpo (figura 1) y los tamaños de característica (Figura 2). Representación de los rasgos de registro se transformó uno contra el otro revela su patrón de covariación dentro de un determinado grupo biológico y permite colocar la relación de escala al grupo (Figura 3). Extracción de los parámetros de escala relación que describen cómo las escalas de forma con el tamaño corporal permite la comparación de la forma cómo covaría con el tamaño de los grupos.
Figura 1. Pupa de los extremos de la distribución del tamaño producido a través de la manipulación de la dieta después de los individuos a alcanzar la E MVW. Real de las imágenes de pupa se muestra a la izquierda con su silueta correspondiente a la medición del tamaño de pupa a la derecha. Barra de escala es de 1 mm.
Alas de la figura 2. Tomada de los extremos de la distribución del tamaño corporal producido por la manipulación de la dieta después de los individuos a alcanzar la E MVW. Las imágenes reales del ala se muestran a la izquierda con su silueta correspondiente a la medición del tamaño de las alas de la derecha. Barra de escala es de 1 mm.
Figura 3. Wing-cuerpo escala de tamaño de Drosophila melanogaster por sexo. Los datos log-transformados para los individuos de cada sexo que fueron totalmente alimentado (ojeras), un muerto de hambre (círculos grises) o dos días (círculos abiertos) en forma de larvas. Tipo de línea de regresión II se muestra para cada sexo. Entre cada grupo de edad, la disminución de superficie alar promedio de ~ 0,1 mm (~ 7%) y ~ 0,2 mm (~ 8%) se produce, el aumento de la gama total de fenotipos observados. Las regresiones muestran que las hembras son ligeramente hypoallometric para esta relación de escala (pendiente de 0,96) mientras que los machos son ligeramente hyperallometric (pendiente 1,06).
Discusión
Escala morfológica ha sido objeto de intenso estudio de la biología evolutiva durante casi un siglo. Más recientemente, la base inmediata de la regulación del crecimiento y la ampliación se ha convertido cada vez más importante en el desarrollo, la fisiología y la genética (por ejemplo, ver en comentarios 12,15,23-25). Nuestra metodología permite la estimación de las relaciones de escala morfológica en toda la gama de rasgos y tamaños corporales. Esto puede ser importante, como el tamaño del rasgo no puede escalar de manera lineal con el tamaño del cuerpo (por ejemplo, 13,14). Sin embargo, esto puede no ser evidente cuando los animales se crían sólo en condiciones de laboratorio ideal.
Aunque el protocolo ha sido desarrollado expresamente para permitir la estimación de la relación de tamaño de las alas del cuerpo de escala en Drosophila, que puede ser utilizado con el rasgo específico de modificación para estimar la relación de escala para cualquier rasgo morfológico de las moscas. Del mismo modo, la manipulación de la dieta probablemente puede ser utilizada para producir toda la gama de tamaños de los rasgos y cuerpo metamórfico de otros insectos en su totalidad; aplicaciones sólo requieren saber cuando el E MVW se logra y la aplicación de la manipulación en ese momento en la ontogenia.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
La investigación descrita en este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias (DEB-0805818) de WAF, AWS y la identificación de este estudio también fue apoyado por subvenciones del IOS-0845847 para AWS, IOS-0919855 de AWS y la identificación y IOS-0920720 para WAF
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