Artículo de método

Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado

DOI:

10.3791/3168

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9 de julio de 2011

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1Defence Medical and Environmental Research Institute, DSO National Laboratories, 2Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Graduate Medical School, 3Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Graduate Medical School

En este artículo

Resumen

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Aprovechando los avances en el desarrollo de fluoróforo y la tecnología de imágenes, un método sencillo de Alexa Fluor etiquetado de los virus del dengue se ideó para visualizar las primeras interacciones entre el virus y la célula.

Resumen

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Los primeros eventos en la interacción entre el virus y la célula puede tener gran influencia en el resultado de la infección. Determinación de los factores que influyen en esta interacción podría conducir a una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad y así influir en el diseño de vacunas o terapéuticos. Por lo tanto, el desarrollo de métodos para investigar esta interacción sería útil. Los recientes avances en el desarrollo de fluoróforos 1-3 y tecnología de imagen 4 puede ser aprovechado para mejorar nuestros conocimientos actuales sobre la patogénesis del dengue y así allanar el camino para reducir los millones de infecciones de dengue ocurren anualmente.

El virus del dengue tiene una envoltura externa andamio que consta de 90 sobre glicoproteína (E) dímeros que protejan el depósito nucleocápside, que contiene una sola hebra de ARN del genoma positivo 5. Las subunidades proteicas idénticas en la superficie del virus por lo tanto pueden ser etiquetados con un colorante reactivo de amina y se visualizan a través de microscopía de inmunofluorescencia. A continuación, presentamos un método simple de etiquetado de los virus del dengue con Alexa Fluor succinimidil éster tinte disuelve directamente en un buffer de bicarbonato de sodio que se produjo el virus altamente viable después del marcaje. No existe un procedimiento normalizado para el etiquetado de los virus vivos y el protocolo existente de un fabricante para el etiquetado de proteínas por lo general requiere la reconstitución de un colorante en dimetilsulfóxido. La presencia de dimetilsulfóxido, incluso en cantidades mínimas, puede bloquear la infección del virus de la producción y también inducir la citotoxicidad celular 6. La exclusión del uso de dimetilsulfóxido en este protocolo lo que reduce esta posibilidad. Alexa Fluor tiene tintes fotoestabilidad superior y son menos sensibles al pH que los tintes comunes, como la fluoresceína y rodamina 2, lo que es ideal para el estudio de la captación celular y el transporte endosomal del virus. La conjugación de Alexa Fluor tinte no afecta el reconocimiento de virus del dengue etiquetados por el virus de anticuerpos específicos y sus supuestos receptores de siete células del huésped. Este método podría tener aplicaciones útiles en los estudios virológicos.

Protocolo

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1. Alexa Fluor etiquetado de los virus del dengue

  1. Antes de la reacción de marcaje, purificar el virus del dengue, con colchón de sacarosa y preparar los reactivos y equipos necesarios, como se indica en el protocolo.
  2. Prepare frescos buffer 0,2 M de bicarbonato de sodio, pH 8.5 (tampón etiquetado), y 1,5 millones de hidroxilamina buffer, pH 8,3 (dejar de reactivo), justo antes de que el etiquetado y el filtro de esterilización con filtros de jeringa 0.2μm.
  3. Diluir aproximadamente 3x10 8 unidades formadoras de placas (UFP) del virus del dengue purificado en 1 ml de buffer de etiquetado en un tubo de 2 ml. Esto puede ser ampliado....

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Discusión

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Aunque AF594 colorante se utilizó en este informe, una amplia gama de fluoróforos en la serie Alexa Fluor ésteres succinimidilo está disponible con la química de etiquetado similar. Esto podría extender la aplicación de etiquetado más allá de la imagen. La citometría de flujo se puede utilizar como una alternativa a la microscopía confocal para estimar el grado de etiquetado para los fluoróforos que puede ser excitado y detectado por la máquina de FACS.

Alexa Fluor colorantes son pequeñas mo.......

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Divulgaciones

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No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo ha sido financiado por la National Medical Research Council, Singapur.

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
De bicarbonato de sodio Sigma-Aldrich S6297
Hidroxilamina Sigma-Aldrich 159417
De hidróxido de sodio Merck 106498
AF594 ésteres succinimidilo Molecular Probes, Invitrogen A20004
PD-10 columna GE Healthcare 17-0851-01
Hepes Sigma-Aldrich H6147
NaCl Sigma-Aldrich S3014
EDTA Sigma-Aldrich E9884
M-199 Invitrogen 11150
FBS Hyclone SH30070.03
4 y placa Nunc 176740
Cubreobjetos Einst 0111520
Portaobjetos del microscopio Vela marca 7105
3H5 hibridoma ATCC HB46
10x PBS Primera base BUF-2040-10X1L
Saponina Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A7906
Cloruro de magnesio Sigma-Aldrich M2670
Cloruro de calcio Sigma-Aldrich C3306
Paraformaldehído Sigma-Aldrich 15,812-7
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Dabco Sigma-Aldrich D27802
Centrífuga de mesa Eppendorf 5424
Microscopio confocal Zeiss LSM 710

Para preparar la M-199 medio de crecimiento, añadir 50 ml de FBS, de 5 ml de piruvato de sodio y 5 ml de la no-aminoácidos esenciales para 500 ml de M-199, filtro estéril.

Para preparar la M-199 medio de mantenimiento, agregar 15 ml de FBS, de 5 ml de piruvato de sodio y 5 ml de la no-aminoácidos esenciales para 500 ml de M-199, filtro estéril.

Referencias

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  1. Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W. The Fluorescent Protein Color Palette. Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).
  2. Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield excep....

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Etiquetas

Dengue Virus LabelingAlexa Fluor DyeImmunofluorescence AssaySize Exclusion ColumnPlaque AssayFluorescent MicroscopyVirus PurificationCellular UptakeEndosomal TransportColocalization Analysis

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