Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Resumen

Un método para expandir las células T γδ a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se describe. PBMC derivados de las células T γδ se estimulan y se expandió con zoledronato y la interleucina 2 (IL-2). La expansión a gran escala de las células T γδ se puede aplicar a la inmunoterapia celular autólogo de cáncer.

Resumen

Humanos γδ células T pueden reconocer y responder a una amplia variedad de estrés inducido por antígenos, por lo tanto el desarrollo de una amplia actividad innata anti-tumoral y anti-infecciosos. ¹ La mayoría de las células γδ T en sangre periférica tienen el receptor de células T Vγ9Vδ2. Estas células reconocen al antígeno en un complejo mayor de histocompatibilidad-de manera independiente y desarrollar una fuerte funciones efectoras citolítica y como ^Th1-1. Por lo tanto, las células γδ T son células efectoras candidato atractivo para la inmunoterapia del cáncer. Vγ9Vδ2 células T responden a phosphoantigens ejemplo, (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), que se sintetiza en las bacterias a través de la biosíntesis de isoprenoides, ² y isopentenil pirofosfato (IPP), que se produce en las células eucariotas a través de la vía del mevalonato. ³ En condiciones fisiológicas, la generación de IPP en células no transformadas no es suficiente para la activación de células T γδ. La desregulación de la vía del mevalonato en las células tumorales conduce a la acumulación de la IPP y la activación de las células T γδ. ³ Porque aminobisfosfonatos (como pamidronato o zoledronato) inhiben la farnesil pirofosfato sintetasa (FPPS), la enzima actúa aguas abajo de la IPP en la vía del mevalonato, los niveles intracelulares de IPP y sensitibity a γδ T reconocimiento de las células pueden ser terapéuticamente aumentó aminobisfosfonatos. IPP acumulación es menos eficiente en las células nontransfomred que las células tumorales con una concentración farmacológicamente relevantes de aminobisfosfonatos, que nos permiten la inmunoterapia para el cáncer mediante la activación de las células T γδ con aminobisfosfonatos. ⁴ Curiosamente, IPP se acumula en los monocitos al PBMC se tratan con aminobisfosfonatos, debido a la eficiente absorción del fármaco por estas células. ⁵ monocitos que se acumulan IPP ser células presentadoras de antígeno y estimular Vγ9Vδ2 las células T en la sangre periférica. ⁶ Basado en estos mecanismos, hemos desarrollado una técnica para la expansión a gran escala de cultivos de células T γδ con zoledronato y la interleucina -2 (IL-2). ⁷ Otros métodos para la expansión de las células T γδ utilizar el sintético de pirofosfato phosphoantigens bromhidrina (BrHPP) ⁸ o 2-metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP). ⁹ Todos estos métodos permiten ex la expansión in vivo, lo que resulta en un gran número de células T γδ para su uso en inmunoterapia adoptiva. Sin embargo, sólo el zoledronato es un reactivo aprobado por la FDA disponibles en el mercado. Zoledronato-ampliado las células T γδ pantalla CD27 ^- CD45RA ^- fenotipo efectoras de memoria y su función puede ser evaluado por el IFN-γ ensayo de producción de ^7.

Protocolo

1. Aislamiento de PBMC

1. Extracción de sangre (7,5-8,0 ml) en un tubo BD Vacutainer CPT preparación celular con heparina sódica. El tubo contiene un anticoagulante con heparina sódica y un fluido de densidad de Ficoll-Hypaque, además de una barrera de gel de poliéster, que separa los dos líquidos. Tubo de centrífuga / muestra de sangre a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) en un rotor horizontal (se gira hacia fuera de la cabeza) durante 20 minutos a 1800 x g. Interruptor de centrífuga de los frenos.
2. Después de la centrifugación, la secuencia de capas se produce de la siguiente manera (visto desde arriba a abajo): un plasma) - b) las cé....

Discusión

El método aquí presentado permite la expansión eficiente de las células T γδ a partir de PBMC. γδ células T activadas y ampliado por zoledronato y la IL-2 desarrollan completar las funciones efectoras, se refleja en la producción de citocinas y citotoxicidad. Se ha informado de que el sintético phosphoantigens pirofosfato bromhidrina (BrHPP) y 2-metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP) también ampliar las células T γδ, sin embargo, no están disponibles comercialmente. En contraste, el zoledronato es que ya tienen licenci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		zoledronato
Proleukin	Novartis Pharmaceuticals		IL-2 recombinante humana
BD Vacutainer CPT Celular preparación del tubo con heparina sódica	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203 medianas	Celular y Ciencia Instituto de Tecnología	0301-7
Optmizer	Invitrogen	0080022SA
A brefeldin	Sigma	B5936-200UL
forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma	P1585-1mg
ionomicina	Sigma	13909-1ML
IntraPrep	BECKMAN COULTER	A07803
anti-humano CD3-FITC o PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-CD4 humano-ECD	BECKMAN COULTER	6604727
anti-humano CD8-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607011
anti-humano CD14-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07765
anti-CD19 humano-PE	BECKMAN COULTER	A07769
anti-CD45 humano-ECD	BECKMAN COULTER	A07784
anti-humano CD56-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07789
anti-humano TCRαβ-PE	BECKMAN COULTER	A39499
anti-humano TCR Vγ9-FITC	BECKMAN COULTER	IM1463
anti-humano CD27-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607107
anti-humano CD45RA-ECD	BECKMAN COULTER	IM2711
anti-CD69 humano-PE	BD	555531
anti-humano NKG2D-PE	BECKMAN COULTER	A08934
Anti-IFN-PE humal	BECKMAN COULTER	IM2717U
Mouse IgG1 control de isotipo-PE	BECKMAN COULTER	A07796
Mouse IgG1-ECD control de isotipo o PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07797 A07798