En vivo doble sustrato bioluminiscentes imagen

Resumen

Aquí describimos los métodos para construir, visualizar y cuantificar las reacciones bioluminiscentes de las enzimas luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla expresadas en células de cáncer de mama metastásico durante su crecimiento y metástasis. in vivo.

Resumen

Nuestro entendimiento sobre cómo y cuándo las células del cáncer de mama transitan desde tumores primarios establecidos hacia sitios metastásicos ha aumentado a un ritmo excepcional desde la aparición de las tecnologías de imagen bioluminiscente in vivo ^1-3. De hecho, la capacidad de localizar y cuantificar longitudinalmente el crecimiento tumoral en un solo grupo de animales hasta la finalización del estudio, en lugar de sacrificar grupos individuales de animales en tiempos específicos del ensayo, ha revolucionado la forma en que los investigadores estudian la metástasis del cáncer de mama. Desafortunadamente, las metodologías actuales excluyen la evaluación en tiempo real de los cambios críticos que ocurren en los sistemas de señalización celular mientras las células del cáncer de mama (i) evolucionan dentro de los tumores primarios, (ii) se diseminan por todo el cuerpo y (iii) reinician programas proliferativos en los sitios de una lesión metastásica. Sin embargo, avances recientes en la imagen bioluminiscente ahora permiten cuantificar simultáneamente cambios espaciotemporales específicos en la expresión génica en función del desarrollo tumoral y la progresión metastásica mediante reacciones de luminiscencia con sustratos duales. Para ello, los investigadores aprovechan dos enzimas luciferasas productoras de luz aisladas de la luciérnaga (Photinus pyralis) y de la anémona de mar (Renilla reniformis), ambas reaccionando a sustratos mutuamente excluyentes, lo que anteriormente facilitó su uso extendido en ensayos in vitro de genes reporteros basados en células ⁴. Aquí demostramos la utilidad in vivo de estas dos enzimas, de modo que una reacción de luminiscencia marca específicamente el tamaño y la ubicación de un tumor en desarrollo, mientras que la segunda reacción luminiscente sirve para visualizar el estado de activación de sistemas de señalización específicos durante etapas definidas del desarrollo del tumor y de la metástasis. Por lo tanto, los objetivos de este estudio son dobles. Primero, describiremos los pasos necesarios para construir líneas celulares reporteras bioluminiscentes duales, así como aquellos requeridos para facilitar su uso en la visualización de la regulación espaciotemporal de la expresión génica durante etapas específicas de la cascada metastásica. Utilizando el modelo 4T1 de metástasis del cáncer de mama, mostramos que la actividad in vivo de un promotor sintético del Elemento de Unión a Smad (SBE) disminuyó drásticamente en la metástasis pulmonar en comparación con la medida en el tumor primario ^4-6. Recientemente, se ha demostrado que la metástasis del cáncer de mama está regulada por cambios en el microambiente del tumor primario y en el estroma reactivo, incluyendo los que ocurren en fibroblastos y células inmunitarias infiltrantes ^7-9. Así, nuestro segundo objetivo será demostrar la utilidad de las técnicas bioluminiscentes duales para monitorear el crecimiento y la localización de dos poblaciones celulares únicas alojadas dentro de un solo animal durante el crecimiento y la metástasis del cáncer de mama.

Protocolo

1. Expresión estable de luciferasa Renilla impulsada por CMV

1. La transfección y selección de una población clonal estable es el método preferido para la expresión de este reportero de luciferasa renilla. Este enfoque proporciona una expresión más consistente y uniforme de la luciferasa renilla tras la introducción subsiguiente de constructos reporteros adicionales secundarios (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga o proteínas fluorescentes).
2. Transfecte células malignas de interés con el vector de expresión que codifica la luciferasa renilla, como pcDNA3.1-Hygro o cualquier otro plásmido que contenga un marcador seleccionable.
3. Tras la transfección, coloque los transfectantes bajo una concentración optimizada de antibiótico durante varios días hasta semanas para facilitar el aislamiento de colonias individuales, que posteriormente se aíslan individualmente y se subcultivan.
4. Seleccione ≥10 colonias individuales que expresen luciferasa renilla para monitorear el grado de expresión de renilla.
5. Las colonias que expresan grandes cantidades de luciferasa renilla se someten posteriormente a análisis funcionales para asegurar que (i) se mantienen las propiedades fisiopatológicas de sus contrapartes parentales, y (ii) los valores de expresión de renilla no se desvíen ni cambien con el tiempo. Estos pasos son absolutamente esenciales para evitar el aislamiento y estudio de variantes o desviaciones clonales, y para validar la integración adecuada del constructo de renilla en el genoma.
6. Una vez aislado y verificado un transfectante estable, se puede eliminar la presión selectiva y tener la certeza de que la expresión de la luciferasa renilla permanecerá constante durante largos períodos de tiempo tanto in vitro como in vivo.

2. Expresión, selección y verificación funcional de la luciferasa de luciérnaga impulsada por un promotor inducible

1. Subclonar el promotor de interés en un plásmido reportero pGL4-luciferasa que contenga un marcador seleccionable (por ejemplo, puromicina) distinto al utilizado para seleccionar la expresión estable de renilla (por ejemplo, higromicina).
2. Transfectar células malignas como en el Paso I, y posteriormente seleccionar una población policlonal estable de células que expresen luciferasa de luciérnaga. Dado que la ubicación donde un gen reportero se integra en el genoma puede provocar efectos erróneos sobre su expresión y regulación, se recomienda encarecidamente seleccionar poblaciones policlonales de células que expresen luciferasa de luciérnaga, en lugar de poblaciones clonales, con el fin de garantizar que (i) la expresión del gen reportero refleje con mayor precisión la del gen endógeno en las células parentales; y (ii) los efectos de integración sobre la expresión génica se promedien y reduzcan a lo largo de la población celular heterogénea.
3. Las células malignas modificadas genéticamente para expresar de forma estable tanto renilla como luciferasa de luciérnaga se denominan colectivamente células reporteras bifotoluminiscentes, o células DBR.
4. Mediante ensayos tradicionales in vitro basados en células para genes reporteros luciferasa, verificar que las células DBR regulen la expresión de luciferasa de luciérnaga, ya sea positiva o negativamente, de manera concordante con lo observado en células parentales transfectadas transitoriamente con estos vectores. Asimismo, verificar que la expresión de renilla impulsada por CMV no sea regulada por diversas estimulaciones celulares ni por condiciones de tratamiento.
5. Para ello, cultivar células DBR y células parentales en placas de 24 pocillos, y posteriormente transfectar transitoriamente las células parentales con los constructos originales de CMV-renilla y promotor-luciferasa de luciérnaga utilizados para generar las células DBR.
6. Posteriormente, tratar las células DBR y las células parentales transfectadas con factores o agentes farmacológicos conocidos por regular el promotor de interés, y cuantificar luego la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga y renilla utilizando el Kit de Ensayo Dual Luciferasa de Promega.

3. Establecimiento de tumores mamarios primarios 4T1

1. Las células de carcinoma mamario 4T1 metastásico que se descubrió que carecían de patógenos roedores adventicios fueron modificadas genéticamente para expresar establemente una luciferasa de renilla impulsada por CMV (pcDNA3.1-CMV-renilla luciferase-hygro) y una luciferasa de luciérnaga impulsada por SBE (pGL4.2-SBE-firefly luciferase-puro), como se describió anteriormente. El trasplante ortotópico de estas células de cáncer de mama da lugar a la formación de metástasis espontáneas principalmente en los pulmones.
2. Las células 4T1 no deben permitirse alcanzar la confluencia durante su propagación en sistemas tradicionales de cultivo celular en 2 dimensiones, y deben ser pasadas el día anterior a su inoculación in vivo.
3. Las células 4T1 deben disociarse mediante tripsinización, lavarse completamente en medio de crecimiento y diluirse en PBS a una concentración de 2x10⁵ células/ml, y almacenarse inmediatamente en hielo.
4. Los ratones hembra Balb/C (de 4 a 6 semanas de edad) deben anestesiarse con una dosis de inducción de isoflurano al 3% y mantenerse bajo anestesia con una dosis de mantenimiento de isoflurano al 1%. Prepare el sitio de inyección limpiándolo con alcohol isopropílico al 70%. Usando una pinza, agarre y levante suavemente la almohadilla mamaria inguinal número 4. Con cuidado, coloque una aguja de calibre 27,5 con el bisel hacia arriba e introdúzcala en la almohadilla grasa mamaria directamente debajo del pezón, teniendo especial cuidado de no introducir la aguja en la cavidad abdominal. Suelte la glándula e inyecte lentamente 50 μl de la suspensión celular (1x10⁴ células) en la almohadilla grasa mamaria.

4. Imagen dual luminiscente inicial

1. Inmediatamente después de injertar las células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria y mientras los ratones aún están anestesiados, inyectar 100 μl de RediJect Coelenterazina en la vena lateral de la cola. Esta es la concentración de sustrato óptima recomendada por el proveedor y la mejor tolerada por el animal.
2. Coloque inmediatamente el ratón dentro del cono nasal de isoflurano del sistema de imagen IVIS-200 y adquiera una imagen luminiscente de 0,5 a 1 minuto de duración. Es muy importante realizar la adquisición de la imagen rápidamente tras la inyección, ya que la señal de la luciferasa de renilla disminuye bruscamente aproximadamente 30 segundos después de la inyección. Devuelva el ratón a su jaula y permita que se recupere durante al menos 1 hora, lo que garantiza que cualquier señal residual de luciferasa de renilla haya desaparecido y que el ratón se haya recuperado completamente de la anestesia.
3. Administrar 150 mg/kg de sal potásica de D-luciferina mediante Inyección i.p. y esperar 5 minutos. Esta es la concentración óptima de D-luciferina, que proporciona una señal luminiscente estable durante 5-15 minutos tras su inyección en los animales de prueba. Anestesiar al ratón con isoflurano y colocarlo nuevamente en el IVIS-200, teniendo cuidado de posicionar al animal en una posición muy similar respecto a la adquisición original de renilla. La intensidad general de esta señal de luciérnaga dependerá de la actividad del promotor de interés, y por lo tanto, la visualización de la actividad de la luciferasa de luciérnaga puede requerir tiempos de adquisición prolongados.
4. Utilizando el software IVIS Living Image configurado en el modo "fotones", establezca los valores para las adquisiciones de renilla y luciérnaga como medio para determinar las relaciones de luminiscencia relativa (RLR) de referencia.

5. Imagen longitudinal luminiscente

1. Las células 4T1 son altamente agresivas, de modo que la inoculación de 1x10⁴ células generalmente provoca la formación de tumores palpables dentro de 1 semana, y la letalidad del animal dentro de 4-5 semanas. Los tumores 4T1 tienen una tendencia intrínseca a ulcerarse en la semana 4. El crecimiento y mantenimiento de tumores ulcerados puede requerir una aprobación separada del IACUC. Los estudios con tumores 4T1 mostrados aquí han sido aprobados por el IACUC de la Universidad Case Western Reserve.
2. Como se describió anteriormente, los ratones deben inyectarse semanalmente con RediJect Coelenterazine para monitorear el crecimiento general del tumor y la metástasis, así como con D-luciferina para monitorear la señalización específica de la vía durante diversas etapas del desarrollo tumoral. Tenga cuidado cada vez de asegurarse de que la señal de luciferasa renilla haya desaparecido completamente antes de adquirir la señal de luciferasa de luciérnaga.
3. A medida que los tumores 4T1 se desarrollan y progresan, las adquisiciones de luciferasa renilla deben normalizarse respecto a los valores iniciales de renilla medidos en el momento de la inoculación de las células tumorales, como medio para normalizar y rastrear el crecimiento del tumor primario. Más importante aún, el cálculo de los valores de RLR a lo largo del tiempo establecerá la regulación temporal de sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento y progresión del tumor.
4. La metástasis pulmonar evidente se vuelve aparente dentro de las 3-4 semanas posteriores al trasplante de células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria. Comparar los valores de RLR pulmonar versus los calculados para el tumor primario establece la regulación espacial de sistemas de señalización individuales en relación con el crecimiento tumoral y la metástasis.

6. Doble imagen bioluminiscente de dos tipos celulares únicos en un solo animal

1. Modifique una línea celular de cáncer de mama para expresar establemente luciferasa renilla impulsada por CMV, como se describió anteriormente. Repita este proceso de modificación utilizando luciferasa luciérnaga impulsada por CMV en una segunda línea celular de cáncer de mama distinta.
2. Aquí mezclamos células 4T1 que expresan luciferasa renilla con sus contrapartes no metastásicas e isogénicas 4T07 que expresan luciferasa luciérnaga^{10, 11}. Se inyectan posteriormente distintas proporciones de estas poblaciones mixtas de células cancerosas de mama en el tejido adiposo mamario, como se describió anteriormente.
3. Adquiera inmediatamente imágenes de luciferasa luciérnaga y renilla para establecer relaciones renilla/luciérnaga (RLR) iniciales representativas de una mezcla celular inoculada determinada.
4. La imagen dual longitudinal de bioluminiscencia permitirá visualizar y rastrear los cambios en la composición celular dentro del tumor primario, así como la metástasis espacio-temporal de cada derivado del cáncer de mama en relación con el crecimiento y progresión del tumor.
5. Alternativamente, se pueden inocular poblaciones celulares individuales de cáncer de mama en diferentes ubicaciones del ratón (es decir, en los tejidos adiposos mamarios abdominales derecho e izquierdo) para evaluar las influencias sistémicas que estas dos poblaciones ejercen entre sí durante diversas etapas del crecimiento tumoral y la metástasis.

7. Resultados representativos:

Una gran ventaja de la imagen dual bioluminiscente radica en que cada imagen es internamente consistente y controlada, de modo que las señales continuas derivadas del tumor primario funcionan como una métrica importante para evaluar el éxito o fracaso general de cada adquisición de renilla y luciferasa de luciérnaga. Este aspecto del procedimiento de imagen es particularmente importante durante la adquisición de la actividad de la luciferasa de renilla, cuyo sustrato coelenteracina es altamente sensible a la oxidación, lo que provoca su capacidad de auto-luminiscencia. La figura 1A muestra un ejemplo de este efecto secundario, que se manifiesta inmediatamente como señales luminiscentes inespecíficas derivadas del tracto intestinal, no del tumor primario establecido. Típicamente, estas señales inespecíficas de coelenteracina ocurren tras inyecciones intravenosas fallidas de este sustrato de luciferasa de renilla. Sin embargo, una vez que se han obtenido señales robustas de renilla derivadas del tumor primario (figura 1B, imagen izquierda), es seguro proceder a capturar mediciones de señalización específicas de la vía derivadas de la imagen de luciferasa de luciérnaga (figura 1B, panel derecho), cuyo sustrato D-luciferina es altamente estable tras la inyección intraperitoneal y produce niveles despreciables de auto-luminiscencia de fondo.

Figura 1. Adquisición de imágenes bioluminiscentes derivadas de renilla y luciérnaga para calcular RLR in vivo. (A) Un ejemplo de inyección intravenosa fallida de coelenteracina que resulta en una señal inespecífica proveniente del tracto intestinal. El círculo y PT indican la ubicación aproximada del tumor primario. (B) Adquisición exitosa de renilla en un ratón con un tumor primario 4T1 y metástasis pulmonares (panel izquierdo; 4 semanas después del injerto en la almohadilla grasa). La adquisición correspondiente de luciérnaga permite el cálculo de RLR tanto del tumor primario como de sus metástasis pulmonares. (C) Representación gráfica de los RLR del tumor primario y de la metástasis pulmonar calculados a partir de los ratones mostrados en el panel B (n=4).

Discusión

El poder absoluto de las técnicas de imagen bioluminiscente radica en su capacidad para cuantificar el crecimiento tumoral y la metástasis en estudios longitudinales complejos, que en este caso implicaron el uso de células agresivas de cáncer de mama 4T1. Dado que estos procedimientos dependen de la integración estable de constructos reporteros de luciferasa, estas técnicas pueden adaptarse y trasladarse fácilmente a otras líneas celulares de cáncer con distintas latencias tumorales y capacidades metastásicas. De forma similar a los resultados mostrados aquí, calcular tasas específicas de RLR dentro de tumores primarios de desarrollo lento y sus metástasis subsiguientes permite la identificación espaciotemporal en tiempo real de eventos de señalización específicos que ocurren durante la progresión metastásica de los tumores, independientemente de su duración de latencia. Tras la identificación de eventos reguladores específicos del promotor, es importante extirpar tanto el tumor primario como sus lesiones metastásicas para realizar análisis estándar de inmunohistoquímica y de expresión génica diferencial, con el fin de verificar una regulación similar del gen y/o proteína endógenos.

Técnicamente hablando, el desafío principal de los análisis bifotoluminiscentes radica en la duración relativamente corta de las señales de luciferasa de renilla. Por ello, esta técnica de imagen requiere una optimización considerable del procedimiento de inyección en la vena caudal, así como la realización inmediata de imágenes en animales inyectados individualmente, un proceso que consume mucho tiempo y es algo ineficiente en comparación con la obtención de imágenes de luciferasa de luciérnaga. Recientemente, Promega introdujo "Viviren", un sustrato de luciferasa de segunda generación cuyos sitios de oxidación están bloqueados mediante esterificación hasta que esta molécula ingresa a las células, momento en el cual se desesterifica rápidamente. En conjunto, este sustrato novedoso reduce eficazmente la autofotoluminiscencia y la modificación y/o degradación no específica asociada a la autofotoluminiscencia inducida por renilla ¹². Al hacerlo, este nuevo sustrato de luciferasa de renilla produce señales fotoluminiscentes más brillantes; sin embargo, los costos excesivos relacionados con la adquisición y el uso de "Viviren" han limitado considerablemente los estudios necesarios para evaluar la utilidad general de este sustrato en análisis bifotoluminiscentes. Por último, la sensibilidad de cualquier ensayo fotoluminiscente depende críticamente de la cámara CCD que opera en la adquisición de unidades individuales de luz. De hecho, a medida que estas tecnologías mejoran, prevemos un punto en el futuro en el que nuestra capacidad para visualizar reacciones bioluminiscentes complejas mediadas por luz podría llevarse a cabo eficientemente en animales en movimiento libre ¹³.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector	Promega Corp.	E6751
Sistema Glomax Multidetección	Promega Corp.
IVIS serie 200	Caliper Life Sciences
Sistema de ensayo de luciferasa dual	Promega Corp.	E1960
Rediject c–lenteracina-h	Caliper Life Sciences	760506
Sal de potasio de D-luciferina	Caliper Life Sciences	122796