Summary
DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.
Abstract
שמירה על יציבות מזלג השכפול הוא בעל חשיבות עליונה לחלוקת תאים לשמר חיוניות ולמנוע מחלות. התהליכים המעורבים לא רק להבטיח שכפול הגנום נאמן מול נזק לדנ"א אנדוגני אקסוגני, אלא גם למנוע אי יציבות גנומית, גורם סיבתי מוכר התפתחות הגידול.
כאן, אנו מתארים מיקרוסקופיה מבוססי פלואורסצנציה פשוטה וחסכונית שיטה לחזות שכפול הדנ"א בקו B-cell העופות DT40. קו זה התא מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את תפקוד החלבון in vivo על ידי גנטיקה הפוכה בתאים חוליות 1. Fluorography DNA הסיבים DT40 תאים חסר גן מסוים מאפשר להבהיר את הפונקציה של המוצר הזה גנים שכפול דנ"א יציבות הגנום. שיטות מסורתיות כדי לנתח את הדינמיקה מזלג שכפול תאים חוליות להסתמך על מדידת קצב הכוללת של סינתזת דנ"א אוכלוסייה של הדופק שכותרתו תאים. זוהי גישה כמותית אינו מאפשר ניתוח איכותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזה של DNA. לעומת זאת, קצב התנועה של מזלגות פעיל ניתן בעקבות ישירות כאשר באמצעות סיב DNA טכניקה 2-4. בגישה זו, ה-DNA המתהווה מתויג in vivo על ידי שילוב של נוקלאוטידים הלוגניים (איור 1A). לאחר מכן, סיבים בודדים נמתחים לשקופית מיקרוסקופ, ו שכפול ה-DNA קטעי שכותרתו מגואלות נוגדנים ספציפיים דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1B). ייזום של שכפול, כמו גם כיווניות מזלג נקבעת על ידי שימוש רצופות של שני אנלוגים שונה אחרת. יתר על כן, הגישה תיוג כפול מאפשר ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזת ה-DNA בשלב-S, כלומר שכפול מבנים כגון מזלגות שוטף נתקע, מוצא צפיפות שכפול, כמו גם הפסקות מזלג. לבסוף, את הליך הניסוי ניתן להשיגעורך תוך יום, ודורש רק ציוד מעבדה כללי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Protocol
השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום הבא: שוואב ואח', EMBO ג', 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 תא תרבות
חומרים: בסרום שור עוברית (FBS), עוף בסרום, פניצילין / סטרפטומיצין, 2-mercaptoethanol, RPMI
- הכן התרבות התא בינוני: להוסיף FBS 7%, עוף בסרום 3%, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -10 מיקרומטר 2-mercaptoethanol עד בינוני RPMI.
- DT40 התאים גדלים צלוחיות תרבות סטרילי התא ב 38 ° C ו 5% CO 2 בתוך חממה humidified. פיצול תאים מדי יום צפיפות של 5 x 10 5 תאים / מ"ל 6.
2. תיוג בשנת vivo
חומרים: IdU, CldU
- הכינו מלאי של פתרונות אנלוגים נוקלאוטיד: להמיס IdU עד 5 מ"מ ו - 2.5 מ"מ CldU בינוני. מחממים שתי פתרונות בקצרה עד 60 ° C ו מערבולת עד אנלוגי נוקלאוטידיםUES מתמוססים לחלוטין.
- הוסף IdU לריכוז סופי של 25 מיקרומטר עד גדל באופן אקספוננציאלי DT40 תאים לערבב את ההשעיה תא היטב. דגירה התאים למשך 20 דקות ב 38 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר הדגרה עם התווית הראשונה, להוסיף CldU לריכוז סופי של 250 מיקרומטר ולטפל תאים כפי שמתואר בשלב הקודם.
- שטפו תאים עם קרח קר PBS ו resuspend אותם בריכוז של 7.5 x 10 5 תאים / מ"ל בקור PBS. שמור את התאים שכותרתו על הקרח.
ההליך המתואר תיוג הוא רק הצעה והוא יכול להיות שונה כדי לענות על שאלות ספציפיות. נא עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על עיצוב ניסיוני.
3. Cell ו-DNA תמוגה מתפשטת
חומרים: שקופיות זכוכית, תמוגה פתרון סיבים
- הכן את הפתרון תמוגה סיבים: 50 mM EDTA ו - SDS 0.5% ב 200 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5
- 7 Pipet פתרון μl תמוגה על גבי ההשעיה תא ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה לערבב את הפתרונות. דגירה של 2 דקות תמוגה התא כדי להמשיך.
- הטיה שקופיות ° 15 על מנת לאפשר הסיבים להתפשט לאורך השקופית.
- לאחר פתרון סיבים הגיע לתחתית המגלשה, למקם אותו אופקית אוויר יבש. לאחר ייבוש, קו דק, אטום צריך להיות גלוי לאורך השקופית. בשלב זה, תחילת סיבים נמתח יש לסמן בעיפרון כמו אחרי מכתים הקו לא יהיה גלוי יותר. סימן זה יהיה מאוחר לעזור לאתר את סיבי מתחת למיקרוסקופ.
4. Immunofluorescence מכתים
חומרים: מתנול, חומצה אצטית, HCl, BSA 5% ב-PBS, צנצנת מכתים, אנטי BrdU (העכבר) נוגדן,אנטי BrdU (עכברוש) נוגדנים, אנטי עכבר כבשים Cy3 נוגדן, אנטי עכברוש עז אלקסה נוגדן 488 פלואוריד, בינוני Vectashield הרכבה, coverslips, לק
- מגלשות לטבול מתנול / חומצה אצטית (03:01) בצנצנת מכתים ו דגירה במשך 10 דקות.
- לשטוף שקופיות מזוקקים H 2 O, לטבול אז HCl 2.5 M עבור 80 דקות.
- לשטוף שקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות.
- הסר שקופיות מתוך הצנצנת מכתים ולאסוף PBS עודף עם מגבת נייר. מניחים את השקופיות אופקית BSA pipet 5% על גבי שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם coverslip להפיץ את BSA באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה במשך 20 דקות.
- לדלל את הנוגדנים העיקרי BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:25 אנטי BrdU (עכבר) ו 1:400 אנטי BrdU (חולדה).
- הזז את coverslip מעדנות שקופיות הזכוכית כדי להסיר אותו. אין להפעיל כוח אם להחליק כיסוי במקלות לשקופית. שקופית ניתן rehydrated ב PBS עד coverslip הופך רפויד ניתן להסיר בקלות. איסוף עודפי BSA עם מגבת נייר במקום שקופיות אופקית. 50 Pipet μl של הפתרון נוגדן ראשוני על כל שקופית. מכסים שוב עם coverslip להפיץ את הפתרון נוגדנים באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה בתא humidified למשך 2 שעות.
- לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות
- לדלל את נוגדנים משני BSA 5% בכל הריכוזים הבאים: 1:500 כבשים אנטי עכבר Cy3 ו 1:400 עז אנטי עכברוש אלקסה פלואוריד 488.
- החלת 50 μl של הפתרון נוגדנים משני כמתואר עבור נוגדנים ראשוניים. הגנו על שקופיות אור דגירה במשך שעה 1.
- לאחר הסרת coverslips, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות.
- הוסף ירידה של המדיום Vectashield גובר על כל שקופית ולהחיל coverslip. לחץ בעדינות על coverslips ולהסיר את הנוזלים העודפים מסביב עם מגבת נייר. חותם coverslips שקוף עם מסמר פוליס שעות ולתת להם יבש. אחסן את השקופיות ב -20 ° C.
5. תמונה הרכישה
חומרים: מצלמה פלואורסצנטי, מיקרוסקופ
מניחים טיפת שמן טבילה לשקופית קרוב כדי לסמן את העיפרון ולהתחיל באיתור סיבים. בדרך כלל, יש צרור סיבים הראשי, אבל סיבים אלה הם הסתבכו מדי ולא ניתן לנתח מאוחר יותר. להתרחק צרור הראשי כדי למצוא אזורים שבהם סיבים מופרדים בבירור זה מזה (איור 2). היינו לבחור תמונות רק באמצעות ערוץ אחד צבע כדי למנוע הטיה. לאחר מכן, היינו לוקחים כ 10 תמונות של כל קו הזמן, נקודת ריכוז או התא. עם זאת, מספר התמונות תלוי איך סיבים רבים ניתן לספור על כל תמונה. תתקדמי השקופית כדי לקחת את התמונות השונות, כמו אזור אחד של שקופית לא יכול לספק אורכי סיב נציג או שכפול מבנים.
6. ניתוח נתונים
"Jove_content"> חומרים: ניתוח תמונה תוכנית, למשל ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
ייבוא תמונות לתוך תוכנית ניתוח התמונה. מדוד את אורכי של קטעי סיבים ו / או לספור את המבנים שכפול שונים (איור 3). רק לספור סיבים אשר גלויים לעין ואשר לא להאריך מעבר לקצה של התמונה. אנחנו בדרך כלל למדוד את אורך של כ 100 סיבים לספור 150-200 מבנים שכפול והיינו חוזרים ניסויים בודדים לפחות שלוש פעמים.
7. נציג תוצאות:
ה-DNA משוכפל חדש ניתן דמיינו כקווים של נוגדן הנקרא אנלוגים נוקלאוטיד. בניסויים שלנו מזלג מתמשך מיוצג אותות אדום וירוק סמוך (איור 3). פרוטוקול תיוג כפול גם מאפשר לנו להגדיר ארבע כיתות העיקריים של שכפול מבנים: 1) אירועים חדשים ייזום ניתן divid עורך אל המקורות כי ירו בעוד התאים הודגרו עם התווית הראשונה המקורות כי ירו במהלך הדגירה עם התווית השנייה. הראשון מורכב ירוק אדום ירוק אותות השכנות השנייה של קו ירוק בלבד. 2) אירועים סיום להתבטא אדום ירוק אדום אותות סמוכים. 3) מקורות וביניהם אתרים בגנום עם מקורות צפופים. אתרים אלה כוללים מקורות ברציפות אותות סיום. 4) בהתאם לעיצוב הניסוי, נתקע / מזלגות התמוטט יכול להיות מוגדר כאיתות רק 7 אדום או קו אדום ואחריו בדרכי ירוק קצר 8,9.
שימוש בתנאים המתוארים כאן, תאים מסוג בר DT40 יש מזלג מהירות ממוצעת של 0.4 מיקרומטר / min. אנחנו יכולים לזהות כ 63% מזלגות מתמשך, מקורותיה 10%, מזלגות נתקע 16% (שטחים רק אדום), הפסקות 8% סיבים שזורים 3%.
יור 1 "/>
. איור 1 (א) בצד השמאלי של הקריקטורה מתארת את השלב הראשון של ההליך תיוג DNA: הוספת IdU אל DT40 התאים גדל באופן אקספוננציאלי מוביל את אנלוגי נוקלאוטיד להיות משולב בקלות לתוך המוביל מסונתז החדש ואת מפגרת גדילי דנ"א. זה יכול להיות דמיינו באמצעות נוגדן ספציפי, יופיע קו אדום כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ. כתוצאה מכך, הליך אותו הוא חזר עם CldU כפי שמוצג בצד ימין של הדמות. לאחר הדגרה עם אנלוגי נוקלאוטידים השני, מזלג פעיל יהיה גלוי כמו בדרכי אדום ירוק הסמוך. אורך סיב ממוצע הוא יחסי זמן הדגירה של אנלוגים של נוקלאוטידים. (ב) דנ"א DT40 תאים lysed נמתח על ידי כוח הכבידה לשקופית מיקרוסקופ ואת אנלוגים נוקלאוטיד משולבים הם דמיינו ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
igure 2 "/>
באיור 2. תמונה הקרינה נציג מראה סיבים בר DT40 תאים סוג שכותרתו לאחר מכן במשך 20 דקות כל אחד עם IdU ו CldU. רוב הסיבים מופרדים היטב אחד מהשני ולכן יכול להיות מנותח בקלות. הבר לבן מייצג 10 מיקרומטר.
. איור 3 הטכניקה תיוג פעמיים סיבים מאפשר להבחין בין מבנים שכפול שונים; 1 - מזלגות שכפול פעיל, 2 - אתרים חדשים של שכפול הדנ"א (ירי מקורות חדשים), 3 - הפסקות מזלג (שני מזלגות מתכנסים), 4 - סיבים שזורים (אתרים של מקורות צפופים) ו 5 - מזלגות נתקע (אות רק אדום).
Discussion
אנו מתארים שיטה המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-ברמה מולקולה בודדת. בעשר השנים האחרונות, גרסאות שונות של הטכניקה סיב DNA fluorography שפותחו כדי לחזות את תנועת מזלגות שכפול בודדים בתוך תאים חיים. פרמטר קריטי כל הטכניקות הללו היא הליך המשמש כדי להשיג את הטוב ביותר האפשרי מתיחה של ה-DNA על משטחי זכוכית מתן היטב מופרדים סיבי ה-DNA. צעד חיוני כדי להשיג את זה הזמן הדגירה של ההשעיה תא בשקופית מיקרוסקופ, כמו גם זמן תמוגה. פרמטרים אלה תלויים זרימת האוויר ואת הטמפרטורה במעבדה מסוימת, יש לקבוע באופן אמפירי. החלק המעשי של הניסוי סיב ה-DNA נעשה בדרך כלל בתוך יום אחד. עם זאת, רכישת תמונה ניתוח שלאחר מכן הוא יותר זמן רב ודורש תרגול.
פרוטוקול תיוג יכול להיות המודעהapted לענות על בעיות מדעיות שונות: באמצעות סוכן המפריע שכפול במהלך תיוג את הדופק second מפקחת התארכות מזלג / השתהות בתגובה ללחץ replicative. בתרחיש זה, את התווית הראשונה לא צריך להיות דהוי כמו נוקלאוטיד השני הוא הוסיף עודף. לחלופין, תרופות המעכבות שכפול ניתן להשתמש בשילוב או רק לאחר תוספת של התווית הראשונה. זה דורש את התווית הראשונה את התרופה להסירו לפני אנלוגי נוקלאוטידים השני הוא מיושם. הליך זה מאפשר לקבוע את החשיבות של גורמים שונים לתקן את ה-DNA על יציבות replicative מזלג / התאוששות בתנאים של לחץ replicative (מזלג כלומר השתהות ו / או קריסה). ראויים לציון, ניתוח מפורט יותר של פרטי התוכנית שכפול ה-DNA יכול להתבצע תוך שימוש גישות חלופיות שילוב סריקות ה-DNA ואת הקרינה הכלאה באתרה. זה לעומת זאת, היא טכנית יותר מאתגרת ומחייבת expenאלימה עם ציוד.
היכולת לנתח איכותית וכמותית פרטי שכפול הדנ"א מספק כלי הכרחי לחקירת פגמים בשכפול ה-DNA עצמו, כמו גם את המסלולים, כי לדכא יציבות גנומית הקשורים מזלגות שכפול. אין ספק, assay זה יהיה עוד יותר לעזור לשפוך אור על מנגנוני תיקון, שכפול ה-DNA בתיווך המאפשרים לתאים נורמליים להגיב / להסתגל לשינויים סביבתיים, כמו גם כמה תאים סרטניים לנצל מנגנונים אלה להתנגד רעילות של תרופות מיקוד מזלגות שכפול.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ט Helleday וד"ר א Petermann לעזרה עם הטכניקה סיבים, כמו גם אנשי המעבדה לדיון מועיל. WN נתמך על ידי עמיתי מחקר בכיר הבינלאומי של האגודה הבינלאומית לחקר הסרטן ועל ידי הוועדה הפולנית הממלכתית עבור מענק המחקר המדעי (N301 165,935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
