DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

Summary

DT40、モデル脊椎動物の遺伝学的システムは、タンパク質の機能を解析する強力なツールが用意されています。ここでは、単一分子レベルでのDT40細胞におけるS期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定性的な分析を可能にするシンプルな方法を説明します。

Abstract

複製フォークの安定の維持は可能性を維持し、病気を防ぐためにセルを分割するための最も重要なのです。関連するプロセスは、腫瘍の開発で認識原因となる要因を内因性と外因性DNA損傷の顔に忠実なゲノムの重複を確保するだけでなく、ゲノム不安定性を防ぐことだけ。

ここで、我々は、シンプルでコスト効率の良い蛍光顕微鏡ベースの鳥B -細胞株DT40のDNA複製を可視化する方法を説明します。この細胞株は、脊椎動物細胞¹の逆遺伝学によるin vivoでのタンパク質の機能を調査する強力なツールが用意されています。特定の遺伝子を欠損DT40細胞におけるDNAの繊維のフルオログラフィーは1つがDNA複製とゲノムの安定性におけるこの遺伝子産物の機能を解明することができます。脊椎動物の細胞内で複製フォークの動態を分析する従来の方法は、パルス標識した細胞の集団におけるDNA合成の全体的な速度を測定することに依存しています。これは定量的なアプローチであり、DNA合成に影響を与えるパラメータの定性分析のために許可されていません。 DNAの繊維技術^2-4を使用しているときとは対照的に、アクティブなフォークの動きの速度を直接追跡することができる。このアプローチでは、発生期のDNAは、ハロゲン化ヌクレオチドの取り込み（図1A）によって生体内でラベルが付けられています。その後、個々の繊維は顕微鏡のスライド上に引き伸ばされている、と標識DNAの複製の路は、特異的な抗体で染色し、蛍光顕微鏡（図1Bの）によって可視化されています。複製だけでなく、フォークの方向性の開始は​​、異なる2つの修正されたアナログの連続した​​使用によって決定されます。さらに、デュアルラベルをつける方法は、S期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定量分析を可能にする、などの継続的かつストールフォーク、複製起点の密度だけでなく、フォークの終了など、すなわち複製構造。最後に、実験手順は、達成することができます。日以内ED、そして唯一の一般的な臨床検査機器や蛍光顕微鏡が必要です。

Protocol

シュワブら、EMBO J.、29（4）:806 - 18 ^5：メソッドは、次の出版物で使用されていたここで説明する。

1。 DT40細胞培養

材料：ウシ胎児血清（FBS）、ニワトリ血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、2 -メルカプトエタノール、RPMI

1. 細胞培養の培地を準備する：RPMI培地に3％ニワトリ血清、1 ×ペニシリン/ストレプトマイシン及び10μM2 - メルカプトエタノールで7％FBSを追加。
2. DT40細胞は、38で滅菌細胞培養フラスコ中で増殖させる℃、5％加湿インキュベーター中CO _2。 5 × 10 ⁵細胞/ mlの⁶濃度に毎日のセルを分割する。

（2） インビボ標識で

材料：IDU、CldU

1. ヌクレオチド類似体のストック溶液を準備します。培地に2.5 mMまで5 mmとCldUにIDUを溶かす。ヌクレオチドアナログになるまで熱を60〜簡単に解決策の両方° Cと渦UESは完全に溶解されています。
2. 指数関数的にDT40細胞の成長を25μMの最終濃度にIDUを加え、よく細胞懸濁液を混ぜる。 38℃および5％CO ₂で20分間細胞をインキュベートする。
3. 最初のラベルとのインキュベーション後、250μMの最終濃度にCldUを追加し、前の手順で説明したように、細胞を扱います。
4. 氷冷PBSで細胞を洗浄し、冷PBSで7.5 × 10 ⁵細胞/ mlの濃度で再懸濁します。氷上で標識された細胞を保管してください。

説明した標識手順は、単なる提案であり、具体的な質問に対処するために変更することができます。実験計画の詳細については、議論のセクションを参照してください。

3。拡散細胞溶解とDNA

材料：ガラススライド、繊維の溶解液

1. 200mMのトリス- HCl、pH7.5中の50mM EDTAおよび0.5％SDS：繊維溶解液を準備する
2. ピペットで7μlの溶解細胞懸濁液の上にソリューションと穏やかに溶液を混合し、ピペットチップを用いてかき混ぜる。続行する細胞溶解のための2分間インキュベートする。
3. 繊維がスライドに沿って広がるようにする15 °にスライドを傾けて。
4. ファイバーソリューションは、スライドの下部に達すると、空気乾燥するために水平に置きます。乾燥後、薄い、不透明なラインは、スライドに沿って表示されるはずです。この時点で、ストレッチ繊維の始まりは、行がもう表示されません染色後のように鉛筆でマークする必要があります。このマークは、後で顕微鏡で繊維を見つけるのに役立ちます。

4。免疫蛍光染色

材料：メタノール、酢酸、塩酸、PBSで5％BSA、染色瓶、抗BrdU（マウス）抗体、抗BrdU（ラット）抗体、ヒツジ抗マウスのCy3抗体、ヤギ抗ラットのAlexa Fluor ® 488抗体、Vectashieldマウンティング培地、カバーガラス、マニキュア

1. メタノール/ 10分間染色瓶やインキュベートの酢酸（3:1）に浸しスライド。
2. 80分で2.5 M HCl中でその後、浸漬蒸留H ₂ Oでスライドを、洗う。
3. 洗浄は5分間PBSで3回スライド。
4. 染色のjarファイルからスライドを削除し、ペーパータオルで余分なPBSを収集する。水平にスライドを置き、各スライドの上にピペットを5％BSA。スライド上に均等にBSAを広げると20分間インキュベートするカバースリップで軽くスライドしてカバーしています。
5. 1時25抗BrdU（マウス）と1:400抗BrdU（ラット）：以下の濃度で5％BSAで一次抗体を希釈する。
6. それを削除するには、軽くガラススライドダウンカバースリップを移動します。カバースリップをスライドに付着する場合は、 - forceを適用しないでください。カバースリップが緩くなるまで、スライドをPBSで再水和しすることができますdは、容易に取り外すことができます。ペーパータオルで余分なBSAを収集し、水平にスライドを配置。各スライド上に一次抗体溶液のピペットで50μlの。スライド上に均等に抗体溶液を広げると2時間加湿チャンバー内でインキュベートするカバースリップで再びカバー。
7. カバーグラスを除去した後、5分間、スライドをPBSで3回洗浄
8. 1:500ヒツジ抗マウスCy3および1:400ヤギ抗ラットのAlexa Fluor ® 488：以下濃度で5％BSAで二次抗体を希釈する。
9. として一次抗体で説明した二次抗体の溶液50μlを適用します。 1時間の光とインキュベートからスライドを保護します。
10. カバーグラスを除去した後、5分間、スライドをPBSで3回洗浄する。
11. 各スライドにVectashieldマウンティング培地のドロップを追加し、カバースリップを適用します。静かにカバーガラスを押して、紙タオルでその周囲に余分な水分を取り除く。透明な爪ポリスとシールのカバースリップhとそれらを乾燥させます。 -20℃でスライドを保存する

5。画像の取得

材料：蛍光顕微鏡、カメラ

鉛筆のマークの近くにスライド上に液浸オイルのドロップを置き、繊維を位置決め開始。通常は、そこにメインの繊維束があるが、これらの繊維は、あまりにも絡み合い、後で分析することができない。繊維がはっきりと（図2）互いに分離されている領域を見つけるために離れてメインバンドルから移動します。我々はバイアスを避けるために、1つのカラーチャンネルを使用して画像を選択することになります。その後、我々は、各時点、濃度または細胞株の約10枚の写真がかかります。しかし、写真の数は、各画像にカウントすることができますどのように多くの繊維によって異なります。スライドの一つの領域は、代表的な繊維の長さまたは複製構造を提供しないかもしれないので、別の写真を撮ってスライドに沿って移動します。

6。データ分析

材料：画像解析プログラム、例えば、ImageJは（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）

画像解析プログラムに画像をインポートします。線維路の長さを測定および/または異なるレプリケーションの構造（図3）を数える。唯一はっきりと表示されていると画像のエッジ上に拡張されないようになる繊維を数える。我々は、典型的に約100の繊維の長さを測定し、150から200のレプリケーション構造をカウントし、我々は個々の実験を少なくとも3回繰り返します。

7。代表的な結果：

新しく複製されたDNAを抗体標識ヌクレオチド類似体の線として視覚化できます。我々の実験では継続的なフォークは、隣接する赤と緑の信号（図3）として表されます。新しい開始イベントはdividすることができます）1：二重標識のプロトコルはまた、私たちは、レプリケーションの構造の4つの主要なクラスを定義することができます細胞は最初のラベルと番目のラベルとのインキュベーションの間に発射されているの起源とインキュベートしている間、起動された起源にED。前者は、隣接する緑 - 赤 - 緑信号と緑のラインの後者のみで構成されています。 2）の終了イベントは、隣接する赤、緑、赤の信号として現れます。 3）散在の起源は、密な間隔の起源とゲノム中のサイトです。このようなサイトでは、連続した起源と終了の信号で構成されています。実験的な設計に応じて4）、失速/折りたたみフォークはどちら赤のみ信号⁷または短い緑地^8,9に続いて赤い線のように定義することができます。

条件を使用すると、野生型DT40細胞が0.4μm/分の平均フォークの速度を持って、ここで説明する。我々は、約63％進行中のフォーク、10％の起源、16％失速フォーク（赤のみトラクト）、8％の終端および3％散在繊維を検出することができます。

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図1（A）漫画の左側は、DNAのラベリング手順の最初のステップを描いている：。IDUが指数関数的にDT40細胞の成長に追加するには、容易に新たに合成される先行および遅行DNA鎖に取り込まれるヌクレオチドアナログをリードしています。これは、特定の抗体を用いて可視化することができる、と顕微鏡下で観察すると、赤色の線として表示されます。図の右側に示すように続いて、同じ手順がCldUで繰り返されます。第2ヌクレオチドアナログとのインキュベーション後、アクティブなフォークは、隣接する赤と緑道として表示されます。平均繊維長は、ヌクレオチド類似体のインキュベーション時間に比例します。 （B）溶解したDT40細胞からDNAを顕微鏡スライド上に重力によって引き伸ばされ、組み込まれたヌクレオチド類似体は、特異的な抗体と蛍光顕微鏡の使用により可視化される。

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図2代表的な蛍光画像は、その後20分ごとに、IDUとCldUで標識された野生型DT40細胞から繊維を示しています。繊維のほとんどは、お互いから分離されているため、容易に分析することができます。白いバーは10μmを表す。

図は、3重標識の光ファイバ技術は1つが異なるレプリケーション構造を区別することができます、1 -積極的に複製フォーク、2 - DNA複製の新しいサイト（新しい起源の発火）、3 -フォークの終端（二収束フォーク）、4 -散在繊維（近接した起源の部位）と5 - ストールフォーク（赤のみの信号）。

Discussion

我々は、単一分子レベルでのS相中にDNA合成に影響を与えるパラメータの定量分析を可能にする方法を説明します。過去10年間で、DNAの繊維のフルオログラフィー法の異なるバージョンは、生きた細胞内の個々の複製フォークの動きを可視化するために開発されました。すべてのこれらの技術の重要なパラメータは、十分に分離されたDNAの繊維を提供するガラス表面上にDNAの伸縮可能な限り最高を達成するために使用されるプロシージャです。これを達成するための重要なステップは、顕微鏡スライド上に細胞懸濁液だけでなく、溶解時間のインキュベーション時間です。これらのパラメータは、特定のラボでの温度と気流に依存し、経験的に決定されるべきである。 DNAの繊維の実験の実用的な部分は、通常1日以内に行われます。しかし、その後の画像の取得と解析は、より多くの時間がかかり、練習が必要です。

ラベリングのプロトコールは、広告することができます様々な科学的問題に答えることをapted：秒パルスラベリングの間のレプリケーションに干渉するエージェントを使用すると、フォークの伸長/複製ストレスに応答して失速を監視します。このシナリオでは、最初のラベルは、第2ヌクレオチドを​​過剰に添加されるとして洗浄す​​る必要はありません。また、複製を阻害する薬剤を組み合わせてまたは単に最初のラベルの添加後に使用することができます。これは最初のラベルと第二のヌクレオチドアナログが適用される前に削除される薬剤を必要とします。この手順では、1つは、複製ストレスの条件（すなわち、フォークが失速および/または崩壊）の下で複製フォークの安定性/回復に関する様々なDNA修復因子の重要性を決定することができます。注目すべきは、DNA複製プログラムの細目のより詳細な分析は、コーミングDNAと蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせた代替アプローチを用いて行うことができた。しかし、これは技術的に、より困難であると高価が必要ですsive機器。

定性的および定量的DNA複製の明細を分析する能力は、DNA複製自体の欠陥だけでなく、複製フォークに関連付けられているゲノム不安定性を抑制する経路を調査するための不可欠なツールを提供しています。間違いなく、このアッセイは、さらに正常な細胞はがん細胞がこれらのメカニズムは、複製フォークを標的薬の毒性に抵抗するために利用する方法だけでな​​く、環境変化への対応/適応できるよう、レプリケーションを介したDNA修復のメカニズムに光を当てるのに役立ちます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum gold (FBS)	PAA Laboratories	A15-151
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
Penicillin/Streptomycin	PAA Laboratories	P11-010
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	21875
5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU)	Sigma-Aldrich	I7125
5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU)	Sigma-Aldrich	C6891
Microscope slides SuperFrost	VWR international	631-0910
Cover slips No1	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3234
Vectashield mounting medium	H-1000 Vector lab	H-1000
Anti-BrdU antibody (mouse)	BD Biosciences	347580
Anti-BrdU antibody (rat)	Abcam	ab6326
sheep anti-mouse Cy3	Sigma-Aldrich	C2181
goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody	Invitrogen	A110060