Un modelo de la contundente unilateral Lesión Medular Cervical Uso del Impactador Infinite Horizon

Resumen

Una manera confiable y repetible para producir una lesión unilateral del cuello uterino de la médula espinal con el impactador horizonte infinito es descrito. El método aprovecha las ventajas de un marco de diseño personalizado y la abrazadera para estabilizar la columna. El procedimiento estandarizado y las lesiones biomecánicas resultado los parámetros de las lesiones suficiente y sostenida.

Resumen

Mientras que la mayoría de los humanos las lesiones de la médula espinal se producen en la médula espinal cervical, la gran mayoría de las investigaciones de laboratorio emplea modelos animales de lesión de la médula espinal (LME) en el que se lesiona la médula espinal torácica. Además, dado que la mayoría de lesiones de la médula humana se producen como resultado de romo, no penetrante traumatismo (accidente por ejemplo, los vehículos de motor, lesiones deportivas) donde se violentamente la médula espinal golpeado por hueso desplazado o tejidos blandos, la mayoría de los investigadores SCI son de la opinión que los modelos de lesión más clínicamente relevantes son aquellos en los que rápidamente la médula espinal contusión. ¹ Por lo tanto, un paso importante en la evaluación preclínica de nuevos tratamientos en su camino a la traducción humana es una evaluación de su eficacia en un modelo de contusión en SCI la médula espinal cervical. A continuación, describimos los aspectos técnicos y la consiguiente los resultados anatómicos y de comportamiento de un modelo unilateral de cuello de útero SCI contundente que emplea elHorizonte infinito de la médula espinal impactador lesión.

Ratas Sprague Dawley, se sometió a una laminectomía unilateral del lado izquierdo en C5. Para optimizar la reproducibilidad de los resultados biomecánicos, funcionales e histológicos del modelo de lesión, contusión la médula espinal utilizando una fuerza de impacto de 150 kdyn, una trayectoria de impacto de 22,5 ° (animales girado a 22,5 °), y un lugar de impacto de de la línea media de 1,4 mm. La recuperación funcional se evaluó mediante la prueba de cilindros de cría, la prueba de escalera horizontal, el aseo y la prueba modificada de Montoya escalera para un máximo de 6 semanas, después de lo cual la médula espinal fueron evaluados histológicamente para la preservación de la materia blanca y gris.

El modelo que aquí se presenta una lesión imparte fuerzas biomecánicas consistentes y reproducibles a la médula espinal, una característica importante de cualquier modelo experimental de SCI. Esto provoca una lesión histológica discreta a la mitad lateral de la médula espinal que se contiene en gran parte a la tque lado ipsilateral de la lesión. La lesión es bien tolerado por los animales, pero da lugar a un déficit funcional de la extremidad anterior que son significativos y sostenidos en las semanas posteriores a la lesión. El modelo de cuello de útero lesión unilateral que aquí se presenta puede ser un recurso para los investigadores que deseen evaluar terapias potencialmente prometedores antes de la traducción humana.

Protocolo

1. Montaje: Estructura y diseño de pinza para sujetar el animal

1. El marco y la pinza para sostener el animal ha sido especialmente diseñada para acomodar el horizonte infinito (IH) Impactador Lesión medular.
2. La base de la estructura es una plataforma de aluminio cortado en las siguientes dimensiones (30,2 cm x 20,3 cm x 1,3 cm) con el fin de encajar en el soporte de guía de la tabla que viene de serie con el dispositivo de IH (Figura 1A).
3. Cuatro placas Flexaframe pie de apoyo (Fisher Scientific, Toronto, ON) se unen a la plataforma y ocho varillas de soporte Flexaframe (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30,5 cm) se reunieron con ocho conectores de apoyo Flexaframe (fig. 1B).
4. Dos conectores adicionales de apoyo Flexaframe, unidos a las medias de dos barras, la casa tiene por encargo de la abrazadera (fig. 1B).
5. El ángulo por el cual la médula espinal del animal se hace girar con respecto a la vertical se establece por keeping uno de la barra horizontal en su lugar y variando la altura de la varilla de otro horizontal (figura 2).
6. La pinza es 35,6 mm de largo, 25,4 mm de alto y con una mandíbula mm 7.6 diseñada para agarrar rígidamente mantenga por debajo de la apófisis transversa de C4 a C6 (fig. 1C). Detalles adicionales sobre el diseño de abrazadera se han descrito anteriormente por Choo y col., 2009.

2. Cirugía

1. Macho Sprague Dawley (Charles River Laboratories) con un peso de 300-350 g se anestesiaron por isoflurano (4% para la inducción y 2% para el mantenimiento) en oxígeno (1 l / min).
2. Una vez que los animales están bajo el plano de la anestesia, el animal se coloca en un marco estereotáxico (Kopf, Tujunga, CA).
3. Para minimizar el sangrado durante el procedimiento quirúrgico 0,4 ml de lidocaína (20 mg / ml; Bimeda - MTC Animal Health Inc., Cambridge, Ontario, Canadá), con la adrenalina se inyecta por vía intramuscular en el área quirúrgica en el dorsol región del cuello.
4. Una incisión 4-5 cm línea media dorsal se realiza utilizando un escalpelo estéril (# 15), a partir de la base del cráneo y que se extiende caudalmente.
5. Pinzas de Adson estériles se usan para diseccionar sin rodeos a través de la musculatura dorsal para llegar a la columna vertebral, y un separador estéril Alm (Herramientas de Bellas ciencia, North Vancouver, BC) se introduce para mantener los músculos se separan.
6. Utilizando el bisturí # 15, los músculos que se superponen las láminas de C4-C7 se raspan, a partir de la línea media y barrer hacia fuera lateralmente.
7. Se hace una incisión con un bisturí estéril (# 15) se hace a los músculos adheridos a los procesos transversales a ambos lados de la columna vertebral con el fin de ajustar la abrazadera por debajo de las apófisis transversas de C4 a C6.
8. Con una multa estéril con punta de Friedman y gubia de Pearson (Herramientas de Bellas ciencia, North Vancouver, BC), la izquierda C5 lámina se retira cuidadosamente para visualizar la duramadre y la médula espinal.
9. Una varilla con un diámetro de 1,5 mm se deslizó debajo de los brazospara sostener al animal, con lo cual la columna vertebral un poco y facilitar la inserción de sujeción.
10. Montar la mordaza de la pinza estéril en laterales apófisis transversas de C4 a C6 y apriete los tornillos.
11. Retire el separador Alm.

3. Lesión de la Médula Espinal

1. Después de la pinza está montada sobre el animal, el animal se mueve a la impactador IH.
2. La pinza se inserta en los titulares de metal en las dos varillas medio del marco que se han protegido con un ángulo de 22,5 ° fuera de la línea horizontal (Figura 2).
3. El gato de tijera que permite ajustes de altura, estables (VWR, Mississauga, ON) se levanta hasta que el animal quede plana.
4. Asegurarse de que la pinza es horizontal mediante la colocación de un nivel pequeño cilindro en la parte superior de la abrazadera y apretando los tornillos. Es importante que todos los tornillos están apretados y la puesta en marcha es rígido sin ningún movimiento.
5. El resto del procedimiento se realiza en un MICRoscope (Leica MZ8).
6. Baje y dirija la punta del impactador (15 mm de diámetro, con bordes redondeados), utilizando la perilla de ajuste vertical y los dos mandos de ajuste horizontal del impactador IH hasta que el centro de la punta del impactador se cierne sobre el ápice del proceso de C6 espinosa.
7. Una vez que la punta impactador está centrada, girar el mando de ajuste del eje y una y dos quinto turno (1,4 mm) para mover la punta lateralmente hacia el lado izquierdo y el mando de ajuste horizontal del eje X para mover la punta impactador al centro de C5.
8. Baje la punta hasta que quede justo por encima de la duramadre para verificar que la punta del impactador tiene como objetivo la mitad lateral de la materia gris.
9. Gire la perilla de ajuste vertical dos vueltas para elevar la punta de 4 mm por encima de la duramadre.
10. Asegúrese de que el área de impacto es en seco mediante el uso de un hisopo de algodón o un palillo.
11. Establecer la fuerza deseada a 150 kdyn sobre el programa y haga clic en "Experimento de Inicio" para activar el impactador.
12. Después de la lesión, la herida se cierra en LayeRS con puntos de sutura vicryl 5-0. La buprenorfina (0,03 mg / kg SC, Temgesic, Schering-Plough Corporation, de Kenilworth, NJ) y solución salina (10 ml) se administra por vía subcutánea dos veces al día antes y dos días después de la cirugía. Los animales son supervisados ​​de cerca dos veces al día durante 2 semanas y uno a la semana durante 6 semanas después de la lesión.

4. Los resultados representativos

Vigésimo Noveno ratas Sprague Dawley (Charles River Laboratories) con un peso de 300-350 g fueron heridos en un ajuste de la fuerza de 150 kdyn. La punta impactador estaba destinado 1,4 mm lateral a la línea media, en un ángulo de 22,5 ° fuera de la vertical. La fuerza real promedio fue de 155,55 ± 0,73 kdyn. El desplazamiento medio fue de 1512,72 ± 27,86 micras y la velocidad era 120,24 ± 0,52 mm / s (Figura 3).

Las medidas de resultado del comportamiento

La recuperación funcional se evaluó mediante la prueba horizontal de escalera, prueba de la crianza del cilindro, la preparación de prueba,y modificar la prueba Montoya escalera ^1. Los animales fueron entrenados y evaluados antes de la lesión en las semanas 2, 4 y 6 después de la lesión. Había deficiencias significativas extremidades anteriores sufridas durante el período experimental.

Prueba de escalera horizontal. Antes de la lesión, los animales sólo hizo 4,75 ± 0,73% los errores en la extremidad anterior ipsilateral al atravesar a través de la escalera horizontal espaciados irregularmente. Después de la lesión, los animales demostraron un marcado incremento en el porcentaje de errores de las extremidades anteriores. Los errores de las extremidades anteriores ipsilaterales por ciento fueron 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% y 22,06 ± 2,05% a los 2, 4 y 6 semanas después de la lesión, respectivamente (Figura 4). Es importante destacar que el deterioro extremidad anterior en esta prueba se mantuvo durante las 6 semanas.

Prueba de Crianza del cilindro. El porcentaje de miembro superior ipsilateral (izquierda y los dos) el uso durante la exploración se redujo significativamente después de la lesión.Antes de la lesión, los animales utilizan la extremidad anterior ipsilateral 75,12 ± 2,25%. Después de la lesión a los animales utilizado el mismo lado extremidad anterior 8,59 ± 1,80% a 2 semanas, 14,25 ± 2,65% a las 4 semanas y 11,76 ± 2,66% a las 6 semanas (Figura 4B).

Modificado prueba de Montoya Escalera. El número de pellets obtenidos con la extremidad anterior ipsilateral disminuyó drásticamente después de la lesión. Antes de la lesión, los animales recogidos 84,85 ± 2,88% de los beneficios de los alimentos. Sin embargo, en las semanas 2, 4 y 6 después de la lesión, los animales recuperados sólo 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% y 25,86 ± 3,09% de los gránulos (Figura 4C).

Grooming prueba. Hubo una disminución drástica en las puntuaciones de aseo después de la lesión. Después de la LME, los resultados fueron ipsilaterales aseo 2 semanas: 2.00 ± 0.17, 4 semanas: 1,83 ± 0,17 y 6 semanas: 1,79 ± 0,11 (FiguRe 4D).

Los resultados histológicos

La materia blanca y la preservación de la materia gris. Un ejemplo de una lesión de la médula espinal en una fuerza de 150 kdyn, el ángulo de 22,5 ° y el objetivo lateral de 1,4 mm, se presentan en la Figura 5. La lesión resultó en un daño sustancial a la materia gris y blanca en el lado ipsilateral. Tanto corticoespinal y vías rubrospinales resultaron heridas y 23 de los 29 animales tuvieron daño parenquimatoso contenida en el lado ipsilateral. La extensión longitudinal de los daños de la sustancia blanca y gris, era de 2400 rostral y caudalmente 2400 (Figura 6). Al agregar las secciones para proporcionar una estimación bruta de la "propagación acumulativo" de la preservación materia blanca y gris (2000 m rostral y caudal al epicentro), el lado ipsilateral sólo tenía el 51,8% de la sustancia blanca a salvo y el 39,7% de la materia gris en comparación restante hacia el lado contralateral (Figura 6).

Figura 1. Horizonte infinito de la médula espinal impactador lesión. A. Impactador horizonte infinito y general establecido. B. Marco de configurar. C. Primer plano de la imagen de la pinza para la celebración de las apófisis transversas cervicales. D. Especificaciones (unidad: pulgadas) de la abrazadera. La tolerancia sugerido <0,002 en (Choo et al. 2009). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2. A. Marco de la ilustración y el correspondiente creado para lograr la rotación de la médula espinal de 0 ° (neutral) o B. 22,5 °, con el objetivo lateral de 1,4 mm.

Figura 3. Representante de la fuerza y el desplazamiento de los gráficos impactador horizonte infinito. La flecha indica el momento en que la punta ha alcanzado impactador 20 kdyn y el momento en que la grabación de desplazamiento se inicia. La fuerza real se lee desde el pico de la curva de fuerza en función del tiempo y el desplazamiento correspondiente se calcula. Los siguientes gráficos muestran una típica 150 contusión kdyn, A. Desplazamiento vs gráfico de tiempo, B. Fuerza vs gráfico de tiempo. Estos gráficos muestran que la fuerza real alcanzada fue de 152 kdyn, y el desplazamiento del impactador en el cable de medida fue de 1287 m. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4. Evaluaciones del comportamiento de la fuerza de 150 kdyn, angulación impactador de 22,5 ° y el objetivo de 1,4 mm a la izquierda de la línea media. A. Prueba de escalera horizontal. B. Prueba de cría del cilindro. C. Modificado prueba de escalera Montoya. D. Grooming prueba. El miembro superior ipsilateral resultado significativo y sostene deficiencias en comparación con la extremidad anterior contralateral.

Figura 5. Imágenes representativas de la médula espinal lesionada de 1600 m rostral a caudal de 1600 m.

Figura 6. Evaluaciones histológicas. A. Porcentaje de materia blanca y gris a salvo. Importa alrededor de 2000 m del epicentro de los daños se libró en gran medida. B. acumulado sustancia blanca y gris a salvo dentro de 2000 m del epicentro del daño. El lado ipsilateral había ahorrado mucho menos materia blanca y gris en comparación con el lado contralateral. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Discusión

En este trabajo se describe un modelo de cuello de útero contusión unilateral con el horizonte infinito (IH) impactador a una fuerza de 150 kdyn, un ángulo de 22.5 ° fuera de la vertical, y un objetivo lateral de 1,4 mm de la línea media. Con estos ajustes, que fueron capaces de producir sostenidos déficits de comportamiento en la extremidad anterior ipsilateral con la interrupción del parénquima contenida en gran parte al lado ipsilateral, donde aparentemente se produjo un daño considerable a las regiones donde las vía...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del equipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Impactador horizonte infinito	Precision Systems e Instrumentación	IH-0400
Aluminio chapa metálica	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Flexaframe placas de soporte del pie	Los pescadores Científico	1466625Q
Flexaframe varillas de soporte	Los pescadores Científico	1466610GQ
Flexaframe Apoyo Conectores	Los pescadores Científico	1466620Q
Fijar un	Una medida que se		Choo et al.De 2009
Los titulares de metal	Una medida que se		Véase más arriba
Impactador la punta	Una medida que se		Diámetro: 1,15 mm
Marco estereotáxico	David Kopf Instruments	Modelo 900
Nivel del cilindro	Yijia HERRAMIENTAS	YJ-SL0620
Microscopio	Leica		Modelo #: MZ8
Laboratorio de gato de tijera	VWR	12620-902