La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans</em

Resumen

La axotomía con láser seguida de imágenes de lapso de tiempo es una manera sensible de evaluar los efectos de mutaciones en C. elegans sobre la regeneración de axones. Un sistema de ablación láser de alta calidad, pero económico, puede agregarse fácilmente a la mayoría de los microscopios. La adquisición de imágenes de lapso de tiempo durante 15 horas requiere una inmovilización cuidadosa del gusano.

Resumen

La axotomía con láser seguida de microscopía de lapso de tiempo es un ensayo sensible para los fenotipos de regeneración axonal en C. elegans¹. La principal dificultad de este ensayo es el costo percibido ($25-100K) y la experiencia técnica necesaria para implementar un sistema de ablación con láser^2,3. Sin embargo, láseres de pulso de estado sólido de costo moderado (<$10K) pueden ofrecer un rendimiento robusto en ablaciones láser en preparaciones transparentes donde los axones diana estén "cerca" de la superficie del tejido. La construcción y alineación de un sistema pueden completarse en un día. La trayectoria óptica proporcionada por la luz del condensador enfocado hasta el láser de ablación ofrece una guía de alineación conveniente. Un módulo intermedio con todos los elementos ópticos eliminados puede destinarse exclusivamente al láser de ablación y asegura que ningún componente óptico deba moverse durante una sesión de ablación con láser. Un divisor de haz dicróico en el módulo intermedio permite la imagen simultánea y la ablación con láser. Centrar el haz láser con respecto al haz saliente del condensador microscópico enfocado guía la alineación inicial del sistema. Se utilizan diversas lentes para condicionar y expandir el haz láser hasta llenar la abertura posterior de la lente del objetivo elegida. La alineación final y las pruebas se realizan con una lámina de vidrio con superficie frontal reflectante como blanco. La potencia del láser se ajusta para obtener un punto de ablación de tamaño mínimo (<1 µm). El punto de ablación se centra mediante ajustes finos del último espejo montado cinemáticamente respecto a las marcas de puntería fijas en la ventana de imagen. La potencia del láser para la axotomía será aproximadamente 10 veces mayor que la necesaria para el punto de ablación mínimo en la lámina de prueba (esto puede variar según el blanco utilizado). Los gusanos pueden inmovilizarse para la axotomía con láser y la microscopía de lapso de tiempo montándolos sobre almohadillas de agarosa (o en cámaras microfluídicas⁴). Las almohadillas de agarosa se preparan fácilmente fundiendo al 10 % de agarosa en solución salina equilibrada en un microondas. Se coloca una gota de agarosa fundida sobre un portaobjetos y se aplana con otro portaobjetos hasta obtener una almohadilla de aproximadamente 200 µm de espesor (una cinta de espaciado de un solo grosor en portaobjetos adyacentes se utiliza como separador). Se utiliza la tapa de un "Sharpie" para recortar una almohadilla circular de diámetro uniforme de 13 mm. En el centro de la almohadilla se añaden anestésico (1 µL de muscimol 20 mM) y microesferas (comunicación personal de Chris Fang-Yen) (1 µL de poliestireno al 2,65 %, 0,1 µm en agua), seguidos de 3-5 gusanos orientados de forma que queden acostados sobre su lado izquierdo. Se coloca una cubreobjetos y luego se utiliza vaselina para sellarla y prevenir la evaporación de la muestra.

Protocolo

1. Construcción de un sistema de ablación por láser

Use gafas de seguridad del láser y el uso de buenas prácticas de seguridad del láser en la alineación inicial. Nunca mire a través de los oculares cuando el láser está encendido.

1. Organizar los componentes de la placa como se muestra en la fig. 1 (véase también el ejemplo ^2). Perno por el láser (con una placa vertical, si es necesario), después de periscopio, y los apoyos tren elevado.
2. La posición de su microscopio para alinearse con el eje ferroviario. Alinearse con el haz de luz transmitido desde la lente del condensador del microscopio. Alinear la altura de la barandilla (use un nivel) y la posición con una apertura ajustable o una lente colocada en el tren. La apertura o el objetivo debe estar alineada en ambos extremos de la barra a la viga del condensador. Tomas de laboratorio pueden ayudar con el ajuste de altura de la barandilla.
3. Alinear el polarizador Glan-Thompson y media onda placa con el rayo láser. No es necesario el láser para hacer esta alineación. El bEAM sólo tiene que pasar por tanto sin golpear los bordes. Gire el Polarizador para proporcionar una orientación práctica y la posición para el volcado del haz (fig. 1). Que se gire la placa en onda media para ajustar la potencia del láser. Segura los componentes de la placa.
4. Encienda el láser, ajuste la frecuencia del pulso a 100, de modo continuo, y reducir el consumo energético al mínimo el uso de la placa de media onda. Use una nota Post-it o papel óptico para visualizar el rayo láser.
5. Ajustar y fijar los espejos montados en la secuencia cinemática del láser para que el rayo hasta el espejo que está montado en el extremo del tren elevado. El rayo láser debe estar alineada aproximadamente con el centro de los espejos. Los espejos deben estar orientadas a unos 45 grados al eje del haz láser (fig. 1).
6. Grueso ajustar el espejo cinemáticamente montado en la parte superior del periscopio y en el extremo del carril para alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida del microscopio. Tanto el rayo láser y ttransmitió haz de luz del microscopio se pueden visualizar de forma simultánea mediante la inserción de papel en la trayectoria del haz. Asegúrese de que los filtros ND y las aberturas en el módulo intermedio están fuera o totalmente abierta.
7. Finalmente alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida con los ajustes finos en la parte superior del periscopio y los espejos de ferrocarril. Mantenga el papel cerca del espejo de ferrocarril y alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida con el espejo del periscopio arriba. Mantenga el papel, cerca del puerto microscopio y alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida con los ajustes de ferrocarril espejo (fig. 2).
8. La posición de un post-it en la trayectoria del rayo entre la lente condensadora alineados y la torreta objetivo abierto. Usted debe ver el haz de luz transmitida con el rayo láser más pequeño cerca del centro. Use los ajustes finos en el espejo del ferrocarril al centro del haz de láser. Fijar el microscopio en su lugar con abrazaderas.

Los pasos 10.9-1.12 son opcionales, pero es muy fácil y útil para evaluar la alineación y la ablación con láser antes de añadir las lentes de haz en expansión.

9. Apague el láser y realizar el obturador mecánico de seguridad. Gire el dicroico de 50% de la trayectoria del haz. A pesar de que no hay luz láser directo pasará a los oculares, la luz reflejada puede ser muy intensa. Monte la diapositiva de destino para el ajuste fino y la imagen con el objetivo de aceite de 60X. Centrarse en los arañazos en la diapositiva. Puesto en el ND4 y ND8 filtro en el módulo intermedio.
10. La imagen de la meta de diapositivas con tus CLSM, disco giratorio, o el sistema de cámara CCD. Gire el dicroico 50% en la ruta de láser. Desde este punto, nunca se debe mirar a través de los oculares, mientras que la ablación con láser está encendido. Encienda el láser de ablación y establecer el modo de activado, la frecuencia a 100, y el número de pulsos a 10. Asegúrese de que el poder sigue estando ajustado al mínimo con la placa de media onda y luego abrir la válvula de seguridad mecánica. Puede simultaneouimagen socarrona y el uso de la ablación con láser.
11. Mientras que imágenes de la diapositiva de destino, activar la ablación con láser. , Comprobar el destino de un um lugar la ablación 1.10 de diámetro. Secuencialmente quitar filtros ND hasta un punto de ablación que se ve. Ajustar el punto de ablación para el centro de la imagen con el espejo de ferrocarril. Usted tendrá que volver a agregar un filtro ND para tener espacio para aumentar la potencia del láser finamente con la placa de media onda para dar a <1 um lugar de ablación. Imagen de 0,2 um / pixel o menos y ajustar con precisión el punto de ablación para el centro de la imagen (posición con 256.256 512x512 imagen).
12. Comprobar la profundidad de foco y el eje del haz de láser. Enfoque de arriba a abajo 1-2 um y compruebe la posición de ablación y el tamaño del punto de ablación. Si el haz del láser es alineado axialmente el punto de ablación no se moverá. El rayo láser no condicionado a distribuir el poder en varias um (alrededor de 3-5 um de arriba a abajo del foco).

2. Añadir lentes para ampliar el haz de láser para llenar la parte de atrás objetivoapertura y ajuste de convergencia para controlar el enfoque

1. Este sistema utiliza dos Galilea haz expansores para ampliar el haz de láser para llenar la abertura posterior del objetivo (10 mm). Monte el 4 lentes a los transportistas y las incluirá en el ferrocarril (L1f1 + L2f2 y L3f1 '+ L4f2'). Ajustar las posiciones a fin de que todas las lentes están en el mismo eje óptico y exactamente ortogonal al rayo láser (fig. 2).
2. Encienda el láser y ajustarla a la potencia mínima y el modo continuo. Más o menos ajustar la alineación del haz a través de cada lente con papel para ver el haz del láser y de transmisión del haz de luz del condensador del microscopio. Apague y disparo del láser.
3. Remueva las pinzas de un lado del microscopio y deslice el microscopio de la trayectoria del haz láser. Encienda el láser y eliminar obturador de seguridad.
4. El ajuste fino de las lentes y el rayo láser se puede realizar mediante la visualización del haz láser expandido en una pared cercana. El haz se expanden y se contraen cuando el le simétricamenteNSES se mueven. Ajustar los últimos dos espejos montados cinemáticamente para alinear el haz (fig. 3).
5. El perfil del haz alineado y expandido debe ser circular y de un brillo uniforme (fig. 3). El tamaño y la uniformidad de la viga se pueden ver con un post-it en la posición estimada de la apertura del nuevo objetivo.
6. El rayo se debe ajustar a cero la convergencia de los sistemas ópticos infinito. La convergencia se puede estimar observando cómo cambia el tamaño de la viga como se mueve un post-it más lejos de las lentes. Apague el láser y realizar el obturador mecánico.
7. Deslice el microscopio de nuevo en la trayectoria del haz láser utilizando las pinzas fijas para definir la alineación correcta. Vuelva a colocar las abrazaderas en la parte libre del microscopio, pero no apriete.
8. Encienda el láser y retirar el obturador de seguridad. Girar la torreta objetivo de una posición abierta. Coloque un post-it en el escenario. Usted debe ver el rayo láser ampliado y uniforme centrada en la b luz transmitidaEAM del condensador (fig. 4). Es posible que necesite para centrarlo aflojando las abrazaderas de microscopio y empujando con cuidado el microscopio.
9. Involucrar a la persiana de seguridad, y establecer el láser para activar el modo. Gire el objetivo de 60X en su lugar y la imagen de la superficie de arañazos en la diapositiva de destino.
10. Retire el obturador de seguridad, activar la ablación con láser y ajustar la potencia del láser para la ablación punto mínimo. El punto de ablación debe ser circular y dentro de um 5.10 del centro de la imagen.
11. Centro de la mancha de ablación con ajuste fino del espejo ferrocarril cinemáticamente montado. Usted tendrá que ajustar iterativamente los montados de ferrocarril y el espejo del periscopio arriba a llegar al centro el punto de ablación y mantener un perfil de la viga uniforme.
12. Evaluar el foco Z del láser moviendo el foco de forma sistemática y en pasos de 1 um y provocando la ablación con láser. El haz de expansión, alineados, y la convergencia debe ajustar al máximo la ablación en el enfoque de la imagen y débilmente o no un um above o por debajo de enfoque (Fig. 5).
13. Ajustar el enfoque Z de la viga ampliado moviendo la lente L3 del telescopio de Galileo (fig. 2).

3. Laser axotomía y time-lapse microscopía de regeneración axonal

1. Microondas al 10% de agarosa (RPI de Biología Molecular Grado EEO 0,1 A20090) en solución salina balanceada hasta derretido completamente. Ubicado en un plato caliente para mantenerlo fundido durante el uso para el montaje.
2. Una gota de agarosa fundida se coloca sobre un portaobjetos de vidrio y aplanado con otra lámina de vidrio en una plataforma de aproximadamente 200 um de espesor (una sola capa de cinta de tiempo en diapositivas adyacentes se utiliza como separador).
3. A "Sharpie" cap marcador se utiliza para cortar una almohadilla circular de diámetro uniforme de 13 mm.
4. Anestesia (1 ul Muscimol 20 mm) y microesferas (Chris Fang-Yen, comunicación personal) (1 ul 2,65% poliestireno 0,1 um de agua) se agrega al centro de la almohadilla seguida de 3-5 gusanos orientadas de tal forma que se acueste sobre su lado izquierdo . Un cubreobjetos se aplica y luego VaselINE se utiliza para sellar el cubreobjetos y evitar la evaporación de la muestra (fig. 6).
5. La ablación con láser se alinea con punto de mira, como se describió anteriormente, al comienzo de cada sesión. Involucrar a la persiana de seguridad láser.
6. Retire el objetivo de alineación láser y la imagen de un gusano adulto montado con un marcador adecuado fluorescentes en las neuronas. Axones de imagen con un aumento similar (0,2 um / pixel o mayor aumento) y la posición en el punto de mira (fig. 7).
7. Abrir el obturador de seguridad láser y activar la ablación por láser, mientras que la imagen. Evaluar el axón después de la activación del láser y poco a poco aumentar la potencia del láser hasta que el axón se corta. Se necesitan unos 10 veces más energía láser para cortar los axones más que para formar un punto de ablación en la diapositiva de destino de alineación (sobre 1UJ / ns pulso). Por lo general corta con 100 pulsos de 2,5 kHz y alimentación en la posición de 0.27mW (energía promedio medido en muestras con un medidor de energía coherente FieldMaxII láser y ajustado en continuo a 2500 Hz). La ablaciónestablecimiento de la potencia del láser será consistente para el corte de los axones en futuros experimentos (fig. 7).
8. Un axón con éxito corte mostrará un descanso de alrededor de 0,5-1 um sin pérdida de brillo en los dos extremos cortados (fig. 7). Una gran pérdida de brillo o una gran brecha (2-10 um) a menudo significa daños más allá del axón de una burbuja de cavitación. Los axones proximales y distales se separan y forman bulbos de retracción en los próximos 30 minutos (fig. 8 y película).
9. Equilibre sus gusanos montado con su platina del microscopio durante 30 minutos antes de comenzar la grabación lapso de tiempo. Esto reducirá al mínimo la deriva debido a las diferencias de temperatura y la contracción de agarosa.
10. ) Lapso de tiempo los parámetros de imagen se configuran mediante el software de imágenes asociadas con el sistema. Por lo general la imagen pasos 10-20 Z (1um/step) a 0,1-0,2 um / pixel con la ganancia, diafragma, velocidad de exploración, y la imagen la configuración de energía láser que minimizar la exposición al tiempo que la resolución espacial deseada. Intervalos de muestreo son típicosly 1-5 minutos más de 15 horas, dependiendo de la resolución deseada temporal (fig. 8 y película).
11. Lapso de tiempo los datos de imagen se convierten en películas usando los elementos de NIS o ImageJ.

4. Los resultados representativos:

Laser axotomía uso de este sistema es un fiable y de rutina. Los resultados se muestran en la figura 7 son típicos. Time-lapse de imágenes de la regeneración axonal es muy robusta, con este protocolo. En forma rutinaria corte y de imagen de hasta 5 axones en 5 gusanos diferentes en una sola diapositiva con una platina motorizada. La única limitación es el tiempo que se tarda en recoger las imágenes de cada axón, por ejemplo, si se tarda 20 segundos para recoger una pila de un axón, entonces la mayoría en el podrá degustar nueve axones (9 pilas) si se toma de muestras cada 180 segundos. El ejemplo que se muestra en las figuras 8 y 9 es el resultado buen representante. Aproximadamente el 10% de los experimentos dan resultados de esta calidad. El resto de experimentos proporcionan datos fiables sobre el fenotipo de la regeneración, pero son estéticamente unappealción, debido a pequeños movimientos de trepidación de la lombriz, que generalmente comienza después de 5-8 horas de inmovilización.

Figura 1 sistema de ablación por láser. La onda de 532 nm Nd: Yag láser está montado sobre una placa vertical para llevarlo a la altura de los otros componentes y atornillados a la placa. (Aislador óptico es opcional y, probablemente, no es necesario). El polarizador Glan-Thompson y la placa de media onda se utilizan para controlar con precisión la potencia del láser. Se monta en la rotación finamente calibrado. Tenga cuidado de establecer el volcado de la viga. El espejo esquina dirige el rayo láser hacia el espejo del periscopio inferior. El espejo del periscopio superior dirige el haz hacia el espejo de ferrocarril. El riel está montado sobre dos plataformas de la barra apoyada. Doble lentes de Galileo se unen a los montajes riel de deslizamiento. Observe el módulo añadido intermedio dedicado a la ablación con láser. El sistema podría ser más compacto mediante la eliminación de la óptica de aislamientotor y el espejo de la esquina, y la recolocación del láser, polarizador Glan-Thompson y la placa de media onda en el borde trasero de la placa.

Figura 2 lentes de doble acondicionado Galileo se utilizan para ampliar la UM 300 TEMoo rayo láser a un tamaño uniforme de convergencia a cero de 10 mm. Un gato de laboratorio se coloca en una de las plataformas de la celebración de la barandilla. Esto ayuda a ajustar la altura de la barandilla durante los pasos de la alineación. Crudamente ajustar la altura de la barandilla de montaje de la lente L1 a la barra y con el haz de condensador como una guía de alineación. Ajuste el riel para que el haz del condensador se alinea con el centro de la lente en ambos extremos de la barra. Esto asegurará que el ferrocarril está alineado en paralelo al eje óptico del microscopio. Puede que tenga que ajustar primero el microscopio para que coincida con el eje óptico del tren. Utilice abrazaderas para fijar la posición del microscopio (ver fig. 1). Quitar ªe sobre carriles de la lente. Ahora alinear el rayo láser hacia el centro de la viga del condensador en ambos extremos de la barra. Un artículo publicado en la trayectoria del haz es una manera conveniente de ver los dos haces de forma simultánea. Use el espejo del periscopio arriba para alinear el rayo láser a la viga del condensador cerca del espejo sobre raíles. Utilice la barra montadas en los espejos para alinear el rayo láser a la viga del condensador en el otro extremo de la barra (la más cercana al microscopio). Ahora montar las cuatro lentes para el ferrocarril, como se muestra en la figura. La longitud del carril, la distancia focal de las lentes y los acuerdos de la lente pueden variar en función de su microscopio y conjunto físico para arriba. Los parámetros críticos son el diámetro del rayo láser y el tamaño de la abertura posterior del objetivo elegido. Infinidad de sistemas ópticos se centrará un rayo láser perfectamente paralelos (cero de convergencia). Distancia entre L1 y L2 deben ser la suma de las lentes de distancia focal, f1 + f2, y la distancia entre L3 y L4 en consecuencia debe ser f1-f2 + '. La distancia entre los díaspares e doble de Galilea no es crítica. Posición de la L3 puede ajustarse con precisión para controlar la convergencia del haz; <1 mm ajustes serán necesarios para ajustar el enfoque del láser para el enfoque de la imagen. Asegúrese de eliminar todas las lentes, filtros, aperturas, etc desde el módulo intermedio que podría estar en la trayectoria del haz (o estar al tanto de lo que hacen y ajustar el sistema en función).

Figura 3 Alineación del haz de láser a través de los lentes de Galileo dual. Retire las abrazaderas microscopio de un lado del microscopio por lo que el microscopio se pueden mover fuera del camino del haz, pero el resto de las abrazaderas permitirá al microscopio para determinar con precisión de posición. Piense en la seguridad del láser. Asegúrese de que la potencia del láser se ajusta al mínimo con el polarizador de Glan-Thompson. Encienda el láser y ver el patrón de rayo láser en la pared. Usted puede encontrar un papel pegado en la pared para ver la ayuda del láserspot. Sistemáticamente ajustar las posiciones de las lentes para tener una idea de lo que hacen con el tamaño del haz y la apariencia. Usted debe ver algo que se parece el panel A, en un lugar es intensa excéntricamente en un perfil de dimmer. Use el espejo sobre raíles para ajustar el punto intenso en el centro como se muestra en el panel B. Ahora usa el periscopio arriba montadas en los espejos para dar un perfil periférica uniforme. Si todo se alinea correctamente, ahora debe encontrar que el traslado de las lentes hace que el haz de expandirse y contraerse simétricamente. Mover las lentes de nuevo a las posiciones de partida, como se muestra en la figura 2. Ahora interceptar el rayo a la distancia de la abertura posterior objetivo. Debe circular, por lo menos lo suficientemente grande como para llenar su apertura hacia atrás, y de un brillo uniforme. Está bien si es más grande, siempre y cuando usted tiene la potencia del láser suficiente para su ablación. Evaluar la convergencia mediante la comparación de diámetro del haz a la distancia de la abertura de nuevo el objetivo y la pared. Haz de diámetro debeser el mismo para un haz de convergencia a cero. Barra de escala es de 10 mm.

Figura 4 Alineación del haz de láser ampliado a la viga del condensador. Del obturador y mover el láser del microscopio de nuevo en la trayectoria del haz de láser utilizando las pinzas como paradas de la alineación. Encienda, alinear y enfocar el haz del condensador, utilizando un objetivo de la lente. Cinta de papel sobre los oculares para evitar que cualquiera pueda ver la intensa luz reflejada del láser. Girar la torreta objetivo de una posición abierta. Ponga un pedazo de papel en el escenario para ocluir el haz de condensador. Gire el láser sobre el modo continuo y eliminar el obturador mecánico de seguridad. Usted debe ver algo de luz láser que viene, aunque el microscopio. Afloje las abrazaderas de microscopio y suavemente empujar el microscopio para alinear el rayo láser con el haz de condensador. El haz de láser debe ser circular y de un brillo uniforme. A veces es útil para adyust el carril montado en lentes. Usted debe ser capaz de expandirse y contraerse el rayo láser de manera uniforme si la alineación es correcta. Puede centrar el haz de láser contratado para el haz de condensador centrada mínimo con el espejo sobre raíles y luego ampliarlo al tamaño deseado. Una vez que ajuste la posición del haz de un contrato con el espejo de ferrocarril, tendrá que volver a ajustar la parte superior espejo montado periscopio para mantener un brillo uniforme del haz expandido. Si usted no puede obtener un haz de láser centrado circular entonces usted tendrá que volver a pasar por los pasos de la alineación anterior.

Figura 5 Centro el punto de ablación y ajustar la convergencia rayo láser para el enfoque óptimo. Apague y disparo del láser. Retire el papel y el montaje de la diapositiva de destino espejo (también se puede utilizar tinta de rotulador permanente en un cubreobjetos como objetivo ^2). Rasguños en la superficie de la imagen reflejada con el 60X lente de aceite 1.4na) Ahora la imagen de la superficie con un confocal o CCD. No mire a través de los oculares, mientras que el láser está encendido. Encienda y unshutter el láser. Ajuste el láser para activar el modo, la potencia más baja, y 100 Hz.. Disparador de 10 pulsos. Usted debe ver un punto de ablación de 1-5 um de diámetro de 10 um del centro de la vista. Si usted no ve un punto de ablación puede aumentar la potencia del láser en los pasos del 5-10%. Una vez que identifique un punto de ablación, el centro para el campo de visión. Poner la cruz en 256, 256 coordenadas si la visualización de imágenes de 512x512. Si ajusta el punto láser en el centro, entonces no va a cambiar de posición con el zoom. Utilice la barra montadas en los espejos para mover el punto de ablación para el punto de mira central. Reevaluar la uniformidad del haz de láser mirando la viga con el objetivo de eliminar como se describió anteriormente en la Figura 4. Ajustar la uniformidad de la viga con el espejo del periscopio montado en la parte superior. Repetir la evaluación de la posición al contado de ablación. Este es un proceso iterativo proceso que se debe repetir hasta que el punto se centra la ablación y el haz de expansión es uniforme. Si se hace correctamente el punto de ablación será circular como se ve en el acto de ablación en foco en la figura. Siguiente evaluar el enfoque del rayo láser en el eje Z. Activar el láser para producir un punto de ablación de alrededor de 1 um en el centro. Ahora mueve la diapositiva alrededor de 5 um lateralmente y se centran 1 um por debajo de la superficie de la diapositiva de destino. Activar el láser con la configuración de láser que se utiliza para el acto de ablación en primer lugar. Repita después de enfocar un um por encima de la superficie de la diapositiva de destino. Si el rayo láser se centra en el enfoque de la imagen, entonces debería ver un patrón similar al mostrado en esta figura. El punto más grande de la ablación debe corresponder al enfoque de la imagen y los puntos de ablación por encima y por debajo de atención deben recibir más pequeñas simétricamente. Ajustar la lente L3 para alinear los planos focales. Mover la lente L3 lejos del microscopio hará que el haz de luz más convergente y el lugar de ablación se acercará ael objetivo. Pequeñas <1 mm ajustes serán necesarios cerca de foco. Ahora está listo para cortar los axones. Barra de escala es de 1 um.

Figura 6 gusanos de montaje para axotomía láser y time-lapse. Agarosa al 10% en solución salina se calienta hasta derretido completamente. Una pequeña gota se coloca en un portaobjetos de vidrio y luego aplanado con otra diapositiva para formar un pedazo de chapa plana. El grosor de la almohadilla se fija con cinta adhesiva en dos diapositivas adyacentes. El pad está autorizado a fijar por cerca de 1 minuto y luego las diapositivas se separan. A "Sharpie" de arriba se utiliza como molde para formar una plataforma de tamaño uniforme, de unos 13 mm. 1 ul de 10 mM muscimol y 1 ul de microesferas se añaden al centro de la almohadilla (Fang-Yen comunicación personal). Los gusanos se agregan a la caída de 2 ul y orientados antes de colocar el cubreobjetos. Vaselina se aplica con una jeringa (20-25 ga. Aguja) hasta el borde del cubreobjetos para sellarlo.

Figura 7 Los resultados típicos de láser axotomía en C. elegans. En una se puede ver el axón intacto poco antes y después de láser axotomía. La diferencia es normalmente alrededor de 0,5 1um. B espectáculos de láser axotomía de un axón sin dañar un axón cerca de 1 um de distancia. Láser se establece en un 10% de potencia (0,3 MW medios a 2500 Hz), y legumbres 100. Barra de escala es de 5 um.

Figura 8. Típico tipo salvaje L4 regeneración. Esta es una serie temporal que muestra la ablación y de lapso de tiempo de grabación de la regeneración de los axones. Poco después de axotomía láser a los 0 minutos se puede ver la bombilla de la retracción. Por 138 minutos, la lámpara de retracción se retiró de nuevo a su extensión más larga y comenzado a remodelar. Protuberancias esporádicos de membrana (mircospikes o filopodios) se puede ver a lo largo del eje del axón (flechas 138 y 324). Lamuñón derecho se extiende un cono bien formado crecimiento compacto a los 360 minutos. En 414 minutos los dos tocones se han extendido los conos de crecimiento. La inicial de tipo embrionario conos de crecimiento se distrófica, ya que se extienden hacia el cordón nervioso dorsal (414, 519 y 597 minutos). Los conos de crecimiento distrófico puesto por debajo del cordón nervioso dorsal (960 minutos). Puntas de flecha señalan muñón proximal y los conos de crecimiento. Las flechas señalan las protuberancias de membrana a lo largo del eje del axón proximal. 20um barra de escala.

Movie 1. Película de la regeneración axonal tipo salvaje. Esta película va de la mano con los puntos de tiempo se muestra en la Figura 8. Los gusanos fueron montadas como se describe en el protocolo y los axones fueron estudiados cada tres minutos durante 10 horas. Z pilas (20 X 1um) fueron tomadas en cada momento y se fusionó en una sola imagen por un algoritmo de proyección máxima (Elementos NIS). Haga clic aquí para ver la película.

Discusión

Existen varias buenas discusiones sobre microcirugía láser con diferentes sistemas láser^3,5-11. Los láseres de infrarrojo de femtosegundo son el "estándar de oro" para la ablación láser subcelular¹² y son convenientes si se asocian con una instalación de imagen, aunque a menudo resultan demasiado costosos para usuarios individuales. Si necesita un láser de infrarrojo de femtosegundo para obtener imágenes de su muestra debido a la profundidad de penetración, probablemente también lo necesitará para la axotomía láser. Los tejidos transparentes con axones diana situados a 30-50 µm de la superficie probablemente sean factibles con láseres pulsados azules y verdes en el rango de 20 µJ/pulso, dirigidos mediante un objetivo de inmersión de alta apertura numérica. Habrá más daño colateral con los láseres de nanosegundo y picosegundo en comparación con el láser de femtosegundo, especialmente a medida que aumenta la profundidad del axón diana. C. elegans es transparente y todos los axones se encuentran a menos de 20-30 µm de la superficie. Habitualmente cortamos axones motores que están a menos de 5 µm de la superficie. También hemos cortado fácilmente axones dentro del anillo nervioso que se encuentran aproximadamente a 20 µm de la superficie de la cutícula. Hemos encontrado que el límite para cortar axones es de aproximadamente 30-50 µm a través del diámetro de un gusano adulto. Es probable que el sistema de ablación láser descrito aquí funcione bien con muchas preparaciones diferentes que cumplan con los criterios de transparencia y profundidad de los axones diana. Aun así, es algo sorprendente, dadas las ventajas teóricas de los láseres de infrarrojo de femtosegundo, que los láseres de 355 nm y 532 nm de nanosegundo y picosegundo funcionen tan bien en la axotomía láser en C. elegans^6,13. No observamos diferencias en la regeneración axonal en respuesta a la axotomía láser realizada con láseres de nanosegundo a 440 nm, nanosegundo a 532 nm y de infrarrojo de femtosegundo.

Los láseres ultravioleta (UV) de estado sólido de 355 nm tienen un costo similar al de los láseres de estado sólido bombeados por diodo y con conmutación pasiva Q a 532 nm, pero requieren potencias más altas o bien óptica que transmita eficientemente estas longitudes de onda más cortas. La mayoría de los componentes ópticos están diseñados para funcionar bien con luz visible de 400-700 nm. Los láseres de 355 nm ofrecerían algunas ventajas⁶, como un umbral de plasma reducido, un tamaño de punto más pequeño y un filtro dicróico de paso largo que dirigiría eficazmente el 100 % del láser de ablación hacia el blanco, permitiendo al mismo tiempo la obtención de imágenes de GFP sin pérdida de señal de la muestra. Los láseres azules de 440 nm conservarían las ventajas de trabajar con un láser de luz visible (buen rendimiento con óptica estándar y mayor seguridad). Desafortunadamente, el costo de un láser de estado sólido DPP con conmutación Q a 440 nm es en la actualidad tres veces mayor que el de un láser de 355 nm o 532 nm de potencia similar. Si estuviéramos diseñando un sistema nuevo para C. elegans, donde la profundidad del blanco es mínima, optaríamos por un objetivo transparente al UV (con un costo de aproximadamente $3.000 para un objetivo de inmersión en aceite 40X 1.3na con una transmitancia del 50-70 % a 355 nm) y un láser de 355 nm que produzca de 5 a 10 uJ por pulso a una frecuencia de 1-20 kHz.

Se cree que la ablación de axones se debe a la formación de plasma. Pulsos más cortos producirán umbrales de plasma a menor potencia y los volúmenes de plasma serán más pequeños⁶. El objetivo consiste en generar el plasma más pequeño y de menor duración ajustando la energía del pulso a la potencia más baja posible. Los plasmas más grandes y duraderos generarán burbujas de cavitación que dañan las células circundantes. En general, hemos encontrado que la ablación utilizando aproximadamente 50-100 pulsos a la frecuencia más alta (es decir, 2,5 kHz) proporciona los mejores resultados. Esto sugiere que el daño puede integrarse progresivamente a través de una serie de pulsos para controlar mejor el grado de daño. El sistema de ablación láser descrito aquí es muy tolerante si el haz se alinea y expande con precisión. Comenzamos a cortar axones en gusanos adultos con un 10 % de potencia láser (un promedio de 0,3 mW medido a 2500 Hz y una estimación de 1 uJ/pulso) y podemos realizar cortes con daño localizado limitado hasta un 14 % de potencia. Se pueden observar áreas de daño más extensas entre el 15 % y el 39 % de potencia láser, pero solo por encima del 40 % de potencia (aproximadamente 1 mW promedio medido a 2500 Hz) los gusanos explotan debido a grandes burbujas de cavitación y daño en la cutícula del gusano.

El artículo de Steinmeyer et al. 2010² es un excelente recurso para construir un sistema de ablación láser. Leon Avery también ofrece una descripción práctica muy útil de un sistema de ablación láser basado en un láser de gas N₂ económico a 337 nm, y proporciona algunos consejos prácticos excelentes (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Al diseñar su propio sistema, primero debe consultar con el representante de su microscopio para determinar cómo dirigir el láser de ablación hacia el objetivo del microscopio. Su microscopio debe montarse sobre una mesa de aislamiento de vibraciones (Newport, TMI, Thor). Una plataforma superior tipo tablero óptico es lo más adecuado, aunque también se puede usar una tapa de acero sólido con posicionadores magnéticos. Es conveniente contar con un módulo intermedio dedicado en un microscopio vertical, ya que todos los elementos ópticos pueden dejarse en su lugar. Sin embargo, puede resultar menos costoso y más práctico utilizar un puerto para cámara (invertido) o un «combinador» conectado a un puerto epifluorescente. Debe conocer el tamaño de la abertura posterior y la transmitancia (a la longitud de onda del láser de ablación) del objetivo que pretende usar. Una vez que decida qué láser utilizar (por ejemplo, Crylas, TEEM, Crystal o CRC), debe contactar a Thor o Newport para obtener ayuda en la selección de los elementos ópticos, hardware y equipos de seguridad adecuados. Optamos por un expansor de haz Galileano doble para ahorrar espacio, aunque también es posible usar un expansor Kepleriano más sencillo (f2/f1 = factor de expansión). Un expansor de haz personalizado será el más económico, pero Newport, Thor y varios fabricantes de láseres ofrecen expandidores comerciales de excelente calidad. Algunos fabricantes de láseres también ofrecen atenuadores manuales y controlados electrónicamente que pueden ser rentables y ahorrar espacio, aunque no son tan versátiles como el polarizador Glan-Thompson y la placa de media onda. También deberá decidir cómo controlar el láser. Puede diseñar un controlador basado en LabView, usar un generador TTL comercial o el software proporcionado por la empresa fabricante del láser. Discuta las opciones con el fabricante específico del láser.

Hemos proporcionado una lista del hardware que hemos utilizado solo como guía general. El sistema descrito aquí costó aproximadamente $15,000 cuando se incorporó a nuestro sistema de imágenes existente. Su departamento local de Física a menudo tendrá alguien dispuesto a ofrecer una introducción práctica al trabajo seguro con láseres de haz libre.

Recientemente se han descrito métodos alternativos para la inmovilización y la obtención de imágenes de lapso de tiempo de C. elegans.¹⁴

Solución de problemas

El paso más difícil y crítico es la alineación del haz expandido centrado con el eje óptico del microscopio. Una vez que tenga el haz centrado y expandido mediante las lentes galileanas, debe esforzarse por alinearlo a menos de 5 µm del eje óptico del microscopio ANTES de usar los espejos de orientación para el ajuste final al centro. El uso excesivo de los espejos de orientación para alinear el haz al microscopio lo desviará del eje a través del expansor de haz. CON EXTREMA PRECAUCIÓN, puede atenuar el haz láser con el filtro ND adecuado y observar directamente el perfil del haz láser sobre un objetivo reflectante (espejo de superficie frontal). Puede empujar suavemente el microscopio para centrar con precisión el haz en el campo de visión del objetivo de 60X (si no puede centrarse en el rango vertical, deberá ajustar la altura del riel). El perfil del haz puede utilizarse para alinear con precisión el eje óptico del microscopio, de modo que el haz quede centrado, circular y con un "abanico" simétrico. Un abanico asimétrico indica que el eje del microscopio no está perfectamente alineado (o que el riel no está nivelado). Finalmente, debe ajustar L3 y observar una expansión y contracción del haz uniforme y simétrica. Enfoque con precisión el microscopio sobre la superficie del objetivo y luego ajuste L3 para enfocar el haz láser en el punto más pequeño posible. En este momento, debería comprobar que el haz láser se encuentra a menos de 5 µm del centro cuando se observa mediante un sistema LSCM o CCD, y que el punto de ablación está a menos de 1 µm del enfoque en Z.

Si observa que está "reventando" gusanos o generando consistentemente grandes burbujas de cavitación para cortar axones, es muy probable que el problema sea el alineado fino del láser de ablación. Asegúrese de que el punto de ablación mínimo (<500nm) esté localizado en el enfoque Z (ajuste la convergencia con la lente L3) y en el punto fiduciario XY (ajuste con el último espejo montado cinemáticamente).

Dirigirse a axones más cercanos a la superficie requerirá menos potencia láser. De manera similar, los animales más pequeños (L1 y L2) requerirán menos potencia láser para la axotomía en comparación con dirigirse a los mismos axones en adultos.

Si sus axones de tipo salvaje no se regeneran o los axones se decoloran, debe intentar reducir la potencia del láser de imagen o disminuir la frecuencia de muestreo. Si sus gusanos mueren o presentan un estado débil, intente reducir el porcentaje de agarosa en pasos del 1%. Asegúrese de no mover la cubeta después de montar los gusanos, ya que esto frecuentemente provoca su muerte cuando se utiliza agarosa de alto porcentaje y microesferas.

Si sus gusanos estallan o mueren durante una sesión de lapso de tiempo, se debe a: 1. El porcentaje de agarosa es demasiado alto. 2. Daño en la cutícula causado por el láser de ablación. 3. Movimiento del cubreobjetos después del montaje. Si el daño en la cutícula es la causa, solo se verán afectados los gusanos montados que hayan sido expuestos al láser de ablación.

Si su gusano se mueve demasiado durante una sesión de lapso de tiempo, intente aumentar el porcentaje de agarosa en incrementos de 0,5 %. Los axones sanos en gusanos sanos siempre son «activos» y muestran un nivel constante de fluorescencia. Si observa una disminución repentina en la fluorescencia o en la actividad, el gusano está muriendo o ya está muerto. La presencia de múltiples axones con aspecto de cuentas o fragmentados es un indicio seguro de que el gusano está muriendo o muerto.

Si tiene dificultades para mantener los axones en foco durante toda la sesión de lapso de tiempo, puede haber varios problemas diferentes. Primero, verifique la deriva de la platina realizando imágenes de una muestra inerte sobre un portaobjetos de vidrio durante 10 horas. Una deriva de algunas micras puede deberse a inestabilidad térmica, pero más de 5 µm probablemente se deba a problemas mecánicos con su microscopio. Los problemas con el montaje son más comunes. Permita que los gusanos montados se equilibren con la platina del microscopio durante 30 minutos antes de comenzar su lapso de tiempo. Verifique que su sellado de vaselina no haya desarrollado fugas durante el transcurso de su sesión de lapso de tiempo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Láser de 535 nm	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM, Crystal y CRC también ofrecen láseres comparables)
Toda la óptica y hardware			(Thor ofrece óptica y hardware comparables)
Soporte óptico SUPREMA, diámetro de 1,0 pulgadas	Newport Corp.	SS100-F2KN	2
Varilla de diámetro 1", altura de 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Horquilla para varilla de diámetro 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Lámina de onda acromática de orden cero, retardo de media onda ½, 400-700 nm	Newport Corp.	10RP52-1	1
Etapa de rotación, apertura de 1"	Newport Corp.	RSP-1T	1
Varilla de diámetro 1", altura de 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Horquilla para varilla de diámetro 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Polarizador de calcita Glan-Láser, 430-700 nm	Newport Corp.	10GL08AR.14	1
Soporte de rotación para polarizador	Newport Corp.	RM25A	1
Espaciador de ¼" para varilla de diámetro 1"	Newport Corp.	PS-0.25	1
Altura de ½", varilla de diámetro 1"	Newport Corp.	PS-0.5	1
Horquilla, varilla de diámetro 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Trampa de haz	Newport Corp.	PL15	1
Soporte para lente de objetivo de microscopio	Newport Corp.	LH-OBJ1	1
Varilla de diámetro 1", altura de 1"	Newport Corp.	PS-1	1
Horquilla para varilla de diámetro 1"	Newport Corp.	PS-F	1
Espejo láser de alta energía Nd:YAG, diámetro de 25,4 mm, 45°, 532 nm	Newport Corp.	10Q20HE.2	4
Soporte óptico SUPREMA, diámetro de 1,0 pulgada, orificio de montaje con holgura	Newport Corp.	SN100C-F	2
Tornillo de ajuste de precisión alta, recorrido de 12,7 mm, 100 TPI	Newport Corp.	AJS100-0.5K	4
Adaptador de rosca, macho ¼-20, hembra 8-32	Newport Corp.	SS-1-B	2
Abrazadera de varilla para varilla de diámetro 1,5 pulgadas	Newport Corp.	340-RC	2
Varilla, altura de 14 pulgadas (35,5 cm)	Newport Corp.	40	1
Portarrail para X26, longitud cuadrada de 40 mm	Newport Corp.	CN26-40	4
Rail de acero, longitud de 384 mm (15")	Newport Corp.	X26-384	1
Plataforma de varilla para varilla de diámetro 1,5 pulgadas	Newport Corp.	300-P	2
Varilla, altura de 14 pulgadas (35,5 cm)	Newport Corp.	40	2
Lente plano-cóncava, diámetro de 12,7 mm, distancia focal efectiva (EFL) de -25 mm, 430-700 nm	Newport Corp.	KPC025AR.14	2
Lente plano-convexa, diámetro de 25,4 mm, distancia focal efectiva (EFL) de 50,2 mm, 430-700 nm	Newport Corp.	KPX082AR.14	1
Lente plano-convexa, diámetro de 25,4 mm, distancia focal efectiva (EFL) de 62,9 mm, 430-700 nm	Newport Corp.	KPX085AR.14	1
Soporte fijo para lente, diámetro de 0,5", altura del eje de 1,0"	Newport Corp.	LH-0.5	2
Soporte fijo para lente, diámetro de 1,0", altura del eje de 1,0"	Newport Corp.	LH-1	2
Microesferas de 0,1 µm	Polysciences, Inc.	00876
Agarosa	Research Products International Corp.	A20090	Importa EEO
Muscimol	Sigma-Aldrich	M1523