Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.
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Artículo de método
Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión
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Resumen
Resumen
TGF-β ha opuesto papel en la progresión del cáncer de mama al actuar como un supresor tumoral en la fase inicial, pero estimulando la invasión y metástasis en 1,2 más adelante. Por otra parte, el TGF-β es frecuentemente sobreexpresado en el cáncer de mama y su expresión se correlaciona con mal pronóstico y la metástasis 3,4. Los mecanismos por los que el TGF-β induce la invasión no se comprenden bien.
TGF-β induce la respuesta celular a través del tipo II de TGF-β (TβRII) y el tipo I (TβRI) receptores. TGF-β sobre la inducida por la formación de complejos heteroméricos, TβRII fosforila la TβRI. El TβRI activado inicia su vía de señalización intracelular canónico por la fosforilación de Smads receptor (R-Smads), es decir, Smad2 y Smad3. Estas activa R-Smads formar complejos con heteroméricos Smad4, que se acumulan en el núcleo y regulan la transcripción de genes diana 5. Además de los anteriores described vía Smad, los resultados de la activación del receptor en la activación de varias otras organizaciones no Smad vías de señalización, por ejemplo la proteína quinasa activadas por mitógeno (MAPK) vías 6.
Para estudiar el papel del TGF-β en las diferentes etapas del cáncer de mama, hemos hecho uso del sistema de células MCF10A. Este sistema se compone de manera espontánea inmortalizado células de la mama MCF10A1 (M1) del epitelio 7, el H-RAS transformó M1 derivados MCF10AneoT (M2), que produce lesiones premalignas en ratones 8, y el MCF10CA1a M2 derivados (M4), que se estableció a partir xenoinjertos M2 y formas de alta carcinomas de grado con la posibilidad de metástasis en el pulmón 9. Esta serie MCF10A ofrece la posibilidad de estudiar las respuestas de las células con diferentes grados de malignidad que no están sesgados por una base genética diferente.
Para el análisis de TGF-β inducida por la invasión, se generó homotípicos MCF10A células esferoide embe culturasñadido en una matriz de colágeno 3D in vitro (Fig. 1). Estos modelos se parecen mucho a los tumores humanos in vivo mediante el establecimiento de un gradiente de oxígeno y nutrientes, lo que resulta en células activas y las operaciones en el exterior y las células en reposo o incluso necrosis en el interior del esferoide 10. Esferoide ensayos basados también han demostrado una mejor resistencia a los medicamentos que recapitular monocapas 11. Este sistema MCF10 modelo 3D nos permitió investigar el impacto de TGF-β señalización en las propiedades de las células de mama invasivo en las diferentes etapas de malignidad.
Protocolo
1. Preparación de la solución Methocel (500 ml)
- Autoclave de 6 g de metilcelulosa en una botella de 500 ml con agitador magnético.
- Disolver la metilcelulosa en 250 ml de DMEM/F12 sin suero precalentado (60 ° C) durante 20 min.
- Añadir 250 ml de DMEM/F12 (RT), que contiene 10% de suero de caballo. Mezcla durante la noche (4 ° C).
- Clara la solución mediante centrifugación (5000 g, 2 h, 4 ° C).
- Tome la solución clara de alta viscosidad a un nuevo tubo (aproximadamente el 90-95% de la solución madre).
- Almacena a 4 º C hasta su uso.
2. Cultura esferoide
- Prepare una solución al 20% metocel (10 ml metocel y 40 ml de medio de crecimiento).
- Lavar las células dos veces con PBS, añadir tripsina al 0,1% y las células se incuban a 37 ° C
- Resuspender las células en medio de crecimiento y el recuento de las células.
- Preparar una suspensión de 10 000 células por ml en el 20% metocel.
- Añadir la suspensión celular a la s 96 de fondo redondo yplacas USPENSIÓN (100 l por pocillo).
- Al día siguiente, consulte la formación esferoide en las placas de suspensión. Esferoides estará listo para su uso después de 1-3 días.
3. Preparación de colágeno
- Prepare en el hielo una solución de colágeno de 8 ml, 1 ml de PBS 10x, 1 ml de NaOH 0,1 N y 3 gotas de HCl 0,1 N. Compruebe si el pH es de 7.4 por manchar algo de la solución en las tiras indicadoras del pH. Ajustar el pH si fuera de rango.
- Añadir 50 l de solución de colágeno neutralizado en los pocillos de una placa de 96 pocillos
- Se incuba a 37 ° C hasta que el colágeno se solidifica (90 min).
- Prepare metocel-ligando colágeno soluciones en el hielo: para cada pipeta ligando una parte de la solución de colágeno. Agregar 20 ng por ml de TGF-β colágeno. Después de la dilución con metocel y difusión sobre las diferentes capas, la concentración final de TGF-β será de 5 ng / ml Mezclar por agitación. Añadir una parte de metocel solución. Mezclar mediante agitación.
4. Esferoide incrustarding
- Coloque una punta de 200 l que tiene aproximadamente 5 mm de la punta cortada, en una pipeta de 200 microlitros. Chupar un esferoide, con la pipeta y cuidadosamente dispensar el medio en un plato vacío. Ver si el esferoide se mantiene dentro de la punta. El esferoide es visible como un punto blanco. Sin soltar el émbolo, absorben 100 l colágeno metocel mezcla y vierta el esferoide en la mezcla de colágeno en el colágeno recubiertas de 96. Haga esto durante 12 esferoides para cada condición.
- Deje que el colágeno se solidifican al menos 30 minutos a 37 ° C
- Eliminar las burbujas de aire con una punta de 200 microlitros.
- Añadir 50 l de medio con el 1,6% de suero y los inhibidores disueltos en DMSO. Para SB-431542 añadir 4 l de solución madre (10 mm) a 1 ml de medio. Después de la difusión, la concentración final de inhibidor de la será de 10 micras. TGF-β y los inhibidores mantendrá el curso del experimento. Tome fotos de los esferoides en el microscopio con aumento de 40x.
- Después de 48h de la estimulación con TGF-β y / o inhibidores, tomar fotos de los esferoides en el microscopio con aumento de 40x.
- Medir el área de los esferoides invasores después de 2 días y restar la zona de salida. La medición de la superficie de un esferoide: Abrir la imagen del esferoide en Adobe Photoshop Extended (figura 2A) y seleccionar la herramienta de selección rápida (Figura 2B). El puntero del ratón se transforma en un círculo con un 'plus' signo (+) (figura 2c). Mientras arrastra el cursor sobre el esferoide, Photoshop se reconocen las fronteras del esferoide. Si un área fuera del esferoide se selecciona, esta región puede ser excluido de la selección pulsando la tecla Alt o mediante el uso de la herramienta de selección negativa que se indica mediante un signo - en la barra de herramientas (). El cursor se convierte en un círculo con un "menos" signo (-) y arrastrando el cursor sobre el área seleccionada erróneamente, esta zona se retira de la selección (figura 2D). Si las regiones es necesario, pueden seleccionar múltiples pulsando el Shbotón ift. Para trabajar con mayor precisión, el tamaño del puntero del ratón se puede ajustar cambiando el diámetro del cepillo en la barra de herramientas (Figura 2E). Cuando el esferoide se selecciona todo el área de la selección se calcula a través de análisis, medida en la barra de menú, o pulsando Ctrl + Mayús + M (figura 2F). La ventana de grabación de medición aparecerá mostrando el nombre del archivo y el área de la selección en píxeles, así como otros datos (figura 2G). Si se miden varias selecciones, la primera línea muestra la suma de todas las áreas. Las medidas de las selecciones individuales se presentan en las líneas de abajo. Los datos de todas las mediciones se pueden exportar a un archivo de texto y se abre en Excel.
5. Los resultados representativos:
Un ejemplo de la prueba esferoide con MCF10A1 (M1), las células epiteliales de mama normales, H-RAS transformó MCF10AneoT (M2) y las células derivadas de MCF10CA1a M2 (M4) se da en la figura 3. Células M1 mostró sólo la invasión débil sinestimulación, pero invadido significativamente mejor a la estimulación por TGF-β. En contraste, el RAS-transforma M1-M2 derivados invadido ya de manera eficiente sin la adición de estímulos, lo que aumentó aún más a 4.5 veces el TGF-β tratamiento. Células M4 mostraron la mayor invasión, con y sin TGF-β además.
A continuación, examinó si se podría interferir con el TGF-β inducida por la invasión de este modelo esferoide el uso de inhibidores químicos. Para ello se utiliza el SB-431542, un análogo de la ATP y el inhibidor selectivo de la actividad quinasa de TβRI, así como la activina tipo IB receptor (ActRIB) y activin receptor de tipo quinasa (ALK) 7 12. Como era de esperar, SB-431542 potentemente inhibida TGF-β inducida por invasión de M1, M2 y M4 células (Fig. 4), lo que indica que el TGF-β invasión inducida es TβRI-quinasa dependiente. Además, la invasión basal de los esferoides también fue fuertemente inhibida, lo que sugiere que la invasión basal es también deindependiente de TGF-β.
Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo esferoide 3D. En primer lugar, las células se colocan en condiciones de no adherentes en forma de U placas suspensiones. Células aggregrate en esferoides multcellular y puede ser embebido en una matriz de colágeno. Dentro de esta matriz de colágeno, que son capaces de invadir.
Figura 2. Cuantificación de la zona de los esferoides con Adobe Photoshop Extended. (A) La imagen del esferoide se abre en Adobe Photoshop Extendend (B) Selección de la herramienta de selección rápida (C) Al arrastrar el cursor sobre el esferoide para seleccionar el área de la esferoidal (D) La eliminación de un área wongly incluyó el uso de la negativo herramienta de selección rápida (E) Ajuste de el tamaño del pincel de la herramienta de selección rápida para seleccionar con mayor precisión la zona (F) La selección de lamedición de comando que desea grabar (G) Ejemplo de un registro de medición.
Figura 3. TGF-β inducida por invasión de esferoides de forma espontánea inmortalizada MCF10A1 (M1) (A), RAS-transforma MCF10AneoT (M2 (B) y sus derivados MCF10CA1a metastásico (M4) (C). M1, M2 y M4 esferoides incrustado en colágeno fueron tratados con 5ng/ml de TGF-β durante 48 horas como se indica. AC imágenes representativas tomadas en el día de la incorporación y dos días después. invasión D relativa se cuantificó como la diferencia de área en el día 2 menos el día 0. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar Adaptado de 13.
Figura 4. Invasión esferoide basal y TGF-β inducida se inhibe la by SB-431542. Esferoides M1, M2 y M4 fueron incorporados en el colágeno y tratados con TGF-β 5ng/ml y / o 10 M SB-431542, como se indica. Imágenes representativas tomadas después de 2 días (A). Invasión relativa se cuantificó como la diferencia de área en el día 2 menos el día 0 (B). Los resultados se expresan como media ± DE Adaptado de 13.
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Discusión
Hemos establecido un modelo esferoide en el que MCF10A1 células y sus derivados malignos invaden en una matriz de colágeno de manera TGF-β-dependiente. En primer lugar, esferoides se forman en 96 pozos de placas de suspensión de fondo redondo, con la presencia de metilcelulosa. Por supuesto, también en forma de U poli-HEMA placas recubiertas se pueden utilizar para este propósito. La metilcelulosa es absolutamente necesario en este paso, ya que las células se mueren en la ausencia de metilcelulosa. TGF-β se añade direct...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés.
Agradecimientos
Damos las gracias a Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, Nueva York, EE.UU.) para los reactivos y Fred Miller (Barbara Ann Intitute Cáncer Karmanos, en Detroit, EE.UU.) para las líneas celulares.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Metil celulosa | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Avanzada Biomatrix | 5005-B | |
| tiras indicadoras del pH | Merck | 9533 | |
| 96 y la suspensión placas | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96-TC y la adhesión placas | Greiner Bio-One | 655 180 |
Referencias
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