Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

Resumen

Este artículo describe un método versátil para crear células derivadas de los anillos de tejido celular por auto-ensamblaje. Las células musculares lisas sembradas en forma de anillo total de agarosa pozos y el contrato de forma sólida en tres dimensiones (3D) de los tejidos dentro de 7 días. A escala milimétrica los anillos de tejido son propicias para los ensayos mecánicos y servir de base para el montaje del tejido.

Resumen

Cada año, cientos de miles de pacientes se someten a cirugía de revascularización coronaria en los Estados Unidos. ¹ Aproximadamente un tercio de estos pacientes no han adecuado los buques cedentes autólogo debido a la progresión de la enfermedad o de la cosecha anterior. El objetivo de la ingeniería de tejidos vasculares es desarrollar una fuente alternativa adecuada para estos injertos. Además, la ingeniería tisular vascular pueden resultar útiles como modelos vivos vascular para estudiar las enfermedades cardiovasculares. Varios enfoques prometedores para los vasos sanguíneos de ingeniería han sido exploradas, con muchos estudios recientes centrados en el desarrollo y el análisis de los métodos basados ​​en células. ^2-5 Aquí, presentamos un método para rápidamente se auto-ensamblan las células en los anillos de tejido 3D que se pueden utilizar en modelo in vitro para los tejidos vasculares.

Para ello, las suspensiones de células de músculo liso se siembran en pocillos de fondo redondo anular agarosa. Las propiedades no adhesivo de la agarosa permitir ªlas células e para resolver, agregar y contrato de alrededor de un poste en el centro del pozo para formar un anillo de tejido cohesionado ^6,7. Estos anillos pueden ser cultivadas durante varios días antes de la cosecha para la mecánica, el análisis fisiológicos, bioquímicos o histológicos. Hemos demostrado que estos anillos de tejidos derivados de células rendimiento a 100-500 kPa fuerza a la tracción ^8, que excede el valor reportado para otras construcciones de ingeniería tisular vascular cultivadas por períodos similares (<30 kPa). ^9,10 Nuestros resultados demuestran que la célula robusta derivados de la generación de tejido vascular del anillo se puede lograr en un corto período de tiempo, y ofrece la oportunidad para la evaluación directa y cuantitativa de los aportes de las células y la matriz de células derivadas de Desarrollo Limpio (MDL) de la estructura del tejido vascular y la función.

Protocolo

1. La siembra de células de fabricación de moldes

Comience por el fresado de una 1 / 2 "pedazo grueso de policarbonato para crear 15, de fondo redondo, pozos anular con un diámetro de poste central de 2 mm. Los canales de fresado de 6 mm de profundidad y 3,75 mm de ancho. Limpie y seque el molde de policarbonato eliminar los residuos plásticos del proceso de molienda.

Mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS) en una proporción de 10:1 (w / w) de la base de que el agente de curado, desgasificar para eliminar todas las burbujas de aire, y se vierte en el molde de policarbonato. Degas de nuevo para eliminar las burbujas restantes, y la curación en el horno a 60 ° C durante 4 horas.

Una vez curado, retire con cuidado la plantilla de PDMS lentamente separándola de la de policarbonato, lavar con agua y jabón, y autoclave. También autoclave una solución de agarosa dos por ciento (w / v) disuelto en medio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM).

Coloque la plantilla de PDMS sobre una superficie plana y se llenan de líquido aga aumentó en un primero de agarosa pipetear en cada uno de los moldes centro de mensaje, a continuación, poniendo en el vaso espacio a su alrededor. Deje que la agarosa a solidificar (15 minutos), luego invierta el molde para liberar la agarosa de PDMS. Corte el exceso de agarosa de todo cada uno de los pozos, y el lugar de los pozos de agarosa en placas de 12 pocillos.

2. Cultivo de células y la siembra de anillo

Añadir celular medios de cultivo (DMEM con FBS al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina) en el exterior del molde de agarosa, sin cubrir la parte superior de los moldes. Coloque las placas en la incubadora y les permite equilibrar durante aproximadamente 15 minutos mientras prepara las células.

A 90% de confluencia, trypsinize células del músculo liso de aorta de rata (CMRE) y volver a suspender a una concentración de 5x10 ⁶ células / ml. Pipetear 100 L de la suspensión celular en cada uno de los pozos de agarosa al anular, mediante un movimiento circular para aplicar las células a cada pocillo.

contenido "> Asegúrese de que los estantes incubadora están al mismo nivel, a continuación, colocar las placas en la incubadora y les permite sentarse en reposo durante 24 horas. Cambio de medio cada dos días después por aspiración de los medios de comunicación de todo el bien, y volver a llenar y cada uno hasta que el agarosa y está completamente sumergida.

3. Tejido de cosecha del anillo y la medición de espesores

Al término de la cultura, retirar el anillo del molde de agarosa al deslizar sobre la parte superior del poste central.

Coloque el anillo en una pequeña placa de Petri con tampón fosfato salino (PBS), el centro de la muestra, y adquirir una imagen utilizando un sistema de imagen digital.

Use un programa de análisis de imágenes para la detección de bordes y medir el grosor del anillo en 4 posiciones (superior, inferior, izquierdo y derecho) alrededor de su circunferencia. Calcular el valor de grosor medio (t) para cada anillo individual, y utilizar este valor para calcular el área de sección transversal(2π (t / ²⁾ 2).

4. Las pruebas mecánicas de los anillos

Configure la máquina de tracción (Instron EPS 1000) en la posición horizontal. Adjunte una célula de carga ± 1N 1mN y la costumbre apretones de alambre delgado (creado por la flexión de alambre de acero inoxidable).

Montar la muestra de anillo en las dos asas de alambre delgado. Se extienden las garras hasta que un 5 mN carga de tara se aplica a la muestra. Entrar en el área de sección transversal (calculado a partir de las mediciones de espesor) y registrar la longitud de referencia.

Pre-ciclo de los anillos de 8 veces entre la carga de tara y 50 kPa tensión a una velocidad de 10 mm / min. Después de la octava pre-ciclo, tirar al fracaso a los 10 mm / min. Si no se observa como una disminución de la fuerza en un 40% de una medición a la siguiente. Para cada muestra, el anillo, medir la carga última (UTS) y la tensión y la falta calcular el máximo módulo tangente (MTM) de los datos adquiridos.

5. Tejidos como el anilloAsamblea para la fabricación de tubos de tejido

Los titulares de costumbre están fabricadas en tubo de discos redondos de 5 cm de policarbonato con cortes rectangulares (2 cm x 3 cm). Perforar los agujeros roscados a través de estos discos para permitir que dos titulares que se atornillan. Autoclave de los titulares de tubo de costumbre, y luego se transfieren a la cabina de bioseguridad y el lugar en un vacío placa de Petri.

Use tijeras quirúrgicas para cortar los extremos de 1,9 mm de diámetro, los tubos de silicona en un ángulo para crear bordes biselados, autoclave y luego los tubos de silicona. Mientras que los tubos están en autoclave, llenar una caja de Petri con medios de comunicación.

Quitar los anillos de los pozos de agarosa y se colocan en la placa de Petri con medios de comunicación. Lugar autoclave tubos de silicona en la misma placa de Petri para humedecerlos antes de su uso.

Use unas pinzas para colocar un extremo biselado de un tubo de silicona en el centro de un anillo y deslice suavemente el anillo en el tubo de silicona. Repita el procedimiento con el número deseado de riNGS. Deslice los anillos en contacto unos con otros con suavidad empujando sucesivamente en ambas direcciones a lo largo del tubo. Este método puede ser utilizado para los anillos de cosecha en un solo día en la cultura.

Una vez que los anillos se montan, alinear los tubos de silicona dentro de los titulares de policarbonato y el tornillo de las dos partes del titular juntos. Coloque el soporte en una placa de Petri de 100 mm y agregar 55 ml de medio. Intercambio de los medios de comunicación cada 3 días durante la duración de la cultura.

Para quitar los tubos de los tejidos, la liberación de los tubos de silicona de la titular de policarbonato y el uso de fórceps para deslizar los tubos de tejido del tubo de silicona y en una placa de Petri llena de PBS.

6. Los resultados representativos:

Cuando el protocolo se realiza correctamente, las células se agregan para formar los anillos de tejido con un diámetro interior igual al diámetro del molde correspondiente mensaje dentro de las 24 horas. Los bordes del anillo son generalmente lisas y en apariencia (si es culturalmenteed en una superficie plana), son uniformes en espesor en toda la circunferencia. Los anillos de los tejidos son fáciles de manejar y pueden ser removidos de sus pozos para su posterior análisis histológico y mecánica (ver en Gwyther et al., 2011 ^8). Morfología de los tejidos del anillo, composición de la matriz, y las propiedades mecánicas varían en función del número y tipo de células sembradas.

Los resultados representativos de los anillos de tejido a partir de diferentes tipos de células, las condiciones de siembra, y la longitud de la cultura se muestran en la Tabla 1. Dos anillos mm de diámetro creado a partir de 5x10 ⁵ CMRE exhibió una UTS superiores a los anillos creados a partir de nuestra publicado anteriormente dos anillos mm (a partir de 6.6x10 ⁵ CMRE). Al igual que las células de rata, las células del músculo liso (hSMC) ⁸ fácilmente agregados para formar tejidos anillos, que contenía una gran cantidad de colágeno después de sólo 14 días de cultivo (datos no mostrados). Las células madre mesenquimales (hMSC) también agregan y forman anillos de cohesión, pero lacked fuerza mecánica y se rompió durante las fases iniciales de las pruebas de precycling tracción uniaxial.

	n	El número de células	Espesor (mm)	Duración de la cultura (días)	UTS (kPa)	MTM (kPa)	Si no la tensión (mm / mm)
CMRE de los anillos	6	660000	0,94 ± 0,12	14	97 ± 30	497 ± 91	0,50 ± 0,08
CMRE de los anillos	4	500000	0,53 ± 0,02	7	113 ± 8	189 ± 15	0,88 ± 0,05
hSMC anillos	3	750000	0,51 ± 0,05	14	160 ± 30	270 ± 20	0,92 ± 0,08
hMSC anillos	3	750000	0,40 ± 0,07	14	N / A	N / A	N / A

Tabla 1. La tabla muestra los parámetros de la cultura y las propiedades mecánicas de dos anillos mm generados a partir de diferentes tipos de células, las concentraciones de la siembra, y la duración de la cultura.

Figura 1. (A) Esquema del proceso de generación de tejido del anillo. (B) Personal de policarbonato molde con fresado anular los pozos. Diámetro central de correos de 2 mm. (C) PDMS plantilla después de que se despega del molde de policarbonato. (D) anillo de tejido agregado cultivadas en un molde de agarosa con un puesto de 2 mm. (E) de diámetro Dos mm anillo de tejido en PBS. Las barras de escala = 6 mm (B, C) y 2 mm (D, E).

Figura 2. Trama Representante de la curva de productores de tensión-deformaciónced de ensayo de tracción uniaxial.

Discusión

Recientemente, ha habido un creciente interés en la base de células o "andamio-menos" los métodos de la ingeniería de tejidos para hacer frente a algunas de las limitaciones de los enfoques basados ​​en los andamios de ingeniería de tejidos. Dado que células derivadas de tejidos creados a partir de las células y la matriz que producen, que sí contienen mucho mayor densidad de células, no contienen materiales exógenos, y se puede hacer todo a partir de células humanas y de las proteínas. Injertos vasculares a partir de células humanas pueden alcanzar una resistencia mecánica considerable en la ausencia de andamios exógenos (por ejemplo, la presión de ruptura 3400 mmHg en comparación con 1600 mm de Hg para la vena safena humana) ^12. Aunque basadas en células tejidos vasculares muestran mejoría en la densidad celular y la resistencia mecánica, métodos de fabricación más reciente (como "hoja de ingeniería con sede en" ^3,4,12 o "bioprinting" ^5,13) requieren largos períodos de cultivo (> 3 meses) o equipos especializados para la construcción de tejido 3D. El derivado de las células del tejido del anillo de metanfetaminaod descrito aquí permite una rápida celular de auto-ensamblaje para formar sólidas construcciones de tejido en 3D en un plazo corto de tiempo y sin el uso de equipo especializado.

Este protocolo se detalla el procedimiento que hemos desarrollado la creación de 2 mm de células derivadas de diámetro interior rata anillos de músculo liso de tejidos. En el presente ejemplo, los anillos de los tejidos se cultivaron durante 7 días (luego cultivaron durante 7 días adicionales para la fusión del anillo y la formación del tubo). Sin embargo, dos ratas mm (y humanos) de las células musculares lisas anillos pueden ser retirados de los pozos y son lo suficientemente coherente para el manejo (por ejemplo, transferir a tubos de silicona) tan pronto como un día después de la siembra de células. Además, los anillos de tejido sólido con distintos diámetros interiores (2, 4 y 6 mm) se pueden crear con este método, simplemente cambiando el diámetro del poste de la original del molde de policarbonato. ⁸ Recientemente también modificó el diseño de moldes de policarbonato para permitir que cinco de 2 pozos mm de sembrar para ser emitidos en una sola cámara multi-y agarosa, queutiliza menos PDMS y agarosa, y cabe en un pocillo de una placa de 6 pocillos (datos no mostrados). Los cambios en el diámetro del poste, el ancho de la siembra, así, el radio de curvatura de la parte inferior redondeada, el número de pozos de la siembra, o la profundidad de los pozos de siembra pueden ser modificados con sólo cambiar las especificaciones en el archivo de CAD para el CNC mecanizado del molde de policarbonato. Finalmente, un solo molde de policarbonato puede ser utilizado para fabricar un número ilimitado de plantillas de PDMS y PDMS cada plantilla se puede limpiar, autoclave y reutilizado docenas de veces.

Además de cambiar el tamaño de los anillos de tejido, hemos hecho los anillos de muchos tipos de células diferentes, incluyendo: SMC primarios de rata (aplicaciones de células, R354-05), principal SMC humanos la arteria coronaria (Lonza, CC-2583), la enseñanza primaria humanos fibroblastos dérmicos ¹¹ (generoso regalo del doctor George Pines, WPI Departamento de Ingeniería Biomédica), fibroblastos de pulmón de rata (RFL-6, ATCC CCL-192), y las células madre mesenquimales (Lonza, PT-2501). Cada uno de estos tipos de células agregados y contratos de todo el centro de mensajes para formar anillos de tejido, aunque la organización celular, la composición de ECM, y las propiedades mecánicas de las construcciones varían para cada tipo de célula. Los parámetros de siembra para cada tipo de célula debe ser determinada empíricamente en función del tamaño de las células y su capacidad de agregar. Por lo tanto, si bien este sistema de creación de células derivadas de los anillos de tejido es extremadamente versátil, el protocolo puede necesitar pequeños ajustes para la formación de tejido óptima con diferentes tipos de células.

La geometría del tejido del anillo facilita una fácil carga y evaluación de las propiedades de los materiales de tejido de ensayo de tracción uniaxial, como se describe. También hay precedentes importantes para el uso de sangre de segmentos de anillos vaso para medir la contracción vascular y la función fisiológica. Estudios preliminares indican que células derivadas de los anillos de tejido puede ser montado en un dispositivo de miografía de alambre para la medición de la respuesta farmacológica ygeneración de la fuerza contráctil (datos no mostrados). En total, la capacidad de fabricar rápidamente auto-ensamblado de anillos de células para el análisis histológico, mecánicos, fisiológicos, bioquímicos y sugiere una nueva y poderosa herramienta que puede ser útil para el modelado de la estructura del tejido vascular y la función de la salud y la enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / equipo	Empresa	Catálogo #
Polidimetilsiloxano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Agarosa	Lonza	50000
DMEM	Mediatech	15 a 017 CV
De suero fetal bovino (FBS)	PAA	A05-201
Penicilina / estreptomicina	Mediatech	30 a 002-CI
Sistema de imagen digital	TVP Corporación	Modelo 630
Máquina de ensayo uniaxial	Instron	ElectroPuls E1000
Software de detección de bordes	TVP Corporación	Marco 2.4.6