Los análisis morfométricos de las Secciones de retina

Summary

Este video muestra tres tipos de análisis morfométricos de la retina, que incluyen la medición del espesor de la capa interna nuclear, cuantificar el número de células ganglionares de la retina (CGR) y la medición de los tamaños de las CGR. La técnica puede ofrecer una plataforma sencilla pero científica de análisis morfométricos.

Abstract

El análisis morfométrico de secciones de retina se han utilizado en el examen de enfermedades de la retina. Por ejemplos, las células neuronales se perdieron significativamente en la capa de células ganglionares de retina (RGCL) en modelos de ratas con N-metil-D-aspartato (NMDA)-inducido excitotoxicidad ^1, la retina isquemia-reperfusión ² y ³ del glaucoma. Reducción de la capa plexiforme INL e interior (IPL) de espesor se revirtieron con el tratamiento con citicolina en los ojos de las ratas sometidas a la excitotoxicidad del glutamato kaínico mediada por el ácido ^4. La alteración de la densidad de CGR y los tamaños de soma se observaron con los tratamientos farmacológicos diferentes en los ojos con presión intraocular elevada ^3,5,6. Por lo tanto, con métodos objetivos de análisis de los morfometría retinianos pueden ser de gran importancia en la evaluación de patologías de la retina y la eficacia de las estrategias terapéuticas.

La estructura de la retina es multi-capas y diferentes tipos de neuronas exiº en la retina. Los parámetros morfométricos de la retina, tales como el número de células, tamaño de la celda y el espesor de las capas diferentes son más complejos que el sistema de cultivo celular. Al principio, estos parámetros pueden ser detectados utilizando otro software de imagen comercial. Los valores son normalmente de valor relativo, y cambiando el valor exacto puede ser necesario el cálculo más exacto. Además, el trazado del tamaño celular y la morfología no puede ser precisa y suficientemente sensible como para el análisis estadístico, especialmente en el modelo de glaucoma crónico. Las medidas utilizadas en este protocolo siempre de una manera más precisa y fácil. Y la longitud absoluta de la línea y el tamaño de la celda se puede informar directamente y fácil de ser copiado en otros archivos. Por ejemplo, se trazó el margen de los núcleos más interior y exterior en el INL y formó una línea a continuación, utilizando el software para dibujar un ángulo de 90 grados para medir el espesor. Aunque sin la ayuda del software, la línea oblicua tal y el cambio de espesor de la retina puedeno ser repetible entre los observadores individuales. Además, el número y la densidad de CGR también puede ser cuantificado. Este protocolo con éxito disminuye la variabilidad en la cuantificación de las características de la retina, aumenta la sensibilidad en la detección de cambios mínimos.

Este vídeo se muestran tres tipos de análisis morfométricos de las secciones de la retina. Estas incluyen la medición del espesor de la INL, que cuantifica el número de las células y medir el tamaño de las CGR en valor absoluto. Estos tres análisis se llevan a cabo con el investigador estéreo (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.). La técnica puede ofrecer una plataforma sencilla pero científica de análisis morfométricos.

Protocol

1. Instrumentos

Microscopio, Nikon

Investigador de música, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.

2. Preparación

1. Antes de trabajar en cualquier análisis morfométricos, cada muestra de retina es seccionadas a 4 micras de espesor y se somete a la tinción H & E.
2. La sección de la retina se divide en 4 regiones: región periférica superior, la región central superior, la región periférica inferior, y la región central inferior.
3. Después de definir las regiones, una imagen de cada región se adquiere en las ampliaciones 10x40 bajo el microscopio de haz brillante de Nikon.
4. Ahora, estamos listos para analizar la morfometría de la retina.

3. Medición de espesor INL

1. Cuatro mediciones del espesor del INL en cada región se midieron. Cuatro líneas se extraerán perpendicularmente desde la línea de base del contorno de la frontera exterior de la INL.
2. Abra el software llamado Investigador estéreo y elegir el lente de 40x de la barra de herramientas principal.
3. Seleccione "Abrir imagen" en la pestaña "Archivo". Elija una imagen de una región que desee la retina que le gustaría analizar.
4. Elija el tipo de línea de contorno del cuadro de lista desplegable de la barra de herramientas principal y pulse el botón "Mover automático".
5. Haga clic derecho en la ventana de localización, y seleccione "Simple Haga clic en localización".
6. Dibuje la curva de nivel a lo largo del borde interior de la INL.
7. Cuando el dibujo se hace, haga clic derecho en la ventana de la búsqueda y elegir la opción "Contorno Open End".
8. Seleccione un marcador en la barra de herramientas de marcadores y añadir marcadores en los puntos de unión.
9. Después de añadir todos los marcadores, deseleccionar el icono de marcador en la barra de herramientas de marcadores.
10. Coloque un cursor en el centro de uno de los marcadores.

11. Seleccione "QuickMedir ángulo "en la pestaña" Herramientas ".

12. Haga clic derecho en la ventana de localización y anular la selección del "continuo" opción.
13. Medir un ángulo por primera haciendo clic en el centro de un marcador, que es adyacente al marcador seleccionado para un extremo del segmento de línea.

14. A continuación, mueva el ratón hacia el centro de la marca en cuestión y haga clic de nuevo.
15. Extender la línea de banda de goma de la frontera exterior de la INL.
16. Ajuste el ángulo de hasta 90 ° se alcanza.

17. Clic izquierdo en la posición deseada. Un cuadro de diálogo que muestra una medición de ángulo aparecerá justo después del clic.
18. Pulse el botónTecla "Enter" mientras se mantiene el ratón todavía.

19. Haz clic izquierdo en la ventana de localización de manera que se dibuja una línea desde un extremo hasta el final elegido nuevo.
20. Haga clic derecho en la ventana de la búsqueda y elegir la opción "Contorno Open End".

21. Dibujar las otras líneas en las posiciones diferentes en la misma forma como se ha descrito antes.
22. Después de dibujar todas las líneas, seleccionar el modo de edición y cambiar el nombre de los 4 segmentos de línea en consecuencia.
23. Cuatro mediciones se puede obtener pulsando el botón "Medición de contorno" botón.
24. Seleccione estas 4 medidas y pegarlos en una hoja de cálculo haciendo clic en "Copiar al portapapeles".
25. Seleccione "Guardar como" en la pestaña "Archivo". Los datos de seguimiento se pueden guardar como un archivo de datos.

1. Seleccione "Abrir imagen" en la pestaña "Archivo". Elija una imagen de una región que desee la retina que le gustaría analizar.
2. Elija el tipo de línea de contorno del cuadro de lista desplegable de la barra de herramientas principal.
3. Dibuja una línea de contorno a lo largo de la frontera de la capa de fibras nerviosas (NFL).
4. Poner fin a la búsqueda en la "Contorno Open End" opción.
5. En cada extremo, añadir un marcador en la punta de la línea y otro en la posición cerca de la punta.
6. Desactive el icono de marcador en la barra de herramientas de marcadores.
7. Coloque un cursor en el centro de los marcadores en la punta.
8. Seleccione "Ángulo Medida rápida" en la pestaña "Herramientas".
9. Haga clic derecho en la ventana de localización y anular la selección del "continuo" opción.
10. Ajuste las líneas de banda de goma y medir un ángulo de 90 °.
11. Pulse la tecla "Enter" después de un cuadro de diálogo está elevado.
12. Izquierda haga clic en tél rastreo ventana de modo que una nueva línea puede ser extendido perpendicularmente desde la punta.
13. Dibuje otra línea nueva en la misma manera en el otro extremo.
14. Dos límites son creados dentro de la cual el número de CGR se cuenta.
15. Elija una frontera como una línea de exclusión que los toques de células no se cuenta.
16. Seleccione un tipo de marcador y colocar uno a cada célula viva.
17. Seleccione otro tipo de marcador de las células muertas.
18. El número de cada tipo de marcadores colocados se mostrará junto al icono de marcador en consecuencia en la barra de herramientas de marcadores.
19. Seleccione el modo de edición y recoger la línea de base del contorno. Haga clic derecho en la ventana de localización y cambiar el nombre de la línea.
20. La longitud de la línea de base del contorno puede ser obtenido mediante prensado "Medida del contorno" botón.
21. El número de las células pueden ser expresados ​​por mm de la longitud.
22. Seleccione "Guardar como" en la pestaña "Archivo". Lala localización y los datos de marcadores se pueden guardar como un archivo de datos.

5. La medición del tamaño de la celda de una celda CGR

1. Seleccione "Abrir imagen" en la pestaña "Archivo". Elija una imagen de una región que desee la retina que le gustaría analizar.
2. Ampliar en una célula viva y elegir el tipo de línea de contorno del cuadro de lista desplegable de la barra de herramientas principal.
3. Dibujar una línea de contorno a lo largo de la circunferencia de la célula.
4. Casi al final, haga clic derecho en la ventana de localización y seleccionar "End contorno de cerca".
5. El área de la celda se muestra con el tema del área en el cuadro de diálogo de medición Contour.

Discussion

1. Cómo obtener una medición de espesores más precisa?

Puede ampliar la imagen haciendo clic en "Zoom" y la izquierda haga clic en la ventana de seguimiento. El borde INL puede verse claramente. Si la punta de la línea no está en la frontera exterior de la INL, podemos ajustar la línea en el modo de edición. Después de recoger la línea en cuestión, haga clic derecho en la ventana de la búsqueda y elegir la opción "Punto de inserción en el contorno seleccionado". Un punto se puede añadir en el b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Tipo	Empresa	Número de catálogo
Investigador estéreo	MBF Software de Análisis de Biociencias	Campo MicroBright
Microscopio	Olympus BX51	Olympus Corporation	BX51