En las secciones siguientes, se describen procedimientos para la preparación de microesferas de alginato para su uso en aplicaciones biomédicas. En especial, ilustran una técnica para la creación de múltiples capas de alginato microesferas para el doble propósito de la celda y la encapsulación de proteínas como un posible tratamiento para la diabetes tipo 1.
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Artículo de método
Generación de microesferas de alginato para aplicaciones biomédicas
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Resumen
Resumen
A base de alginato-materiales han recibido una atención considerable para aplicaciones biomédicas debido a su naturaleza hidrofílica, biocompatibilidad, y la arquitectura física. Las aplicaciones incluyen la encapsulación de células, la administración de fármacos, la cultura de células madre, y los andamios de ingeniería de tejidos. De hecho, los ensayos clínicos se están realizando actualmente en el que los islotes son encapsulados en microesferas de alginato de la OLP, recubiertos en el tratamiento de la diabetes tipo. Sin embargo, un gran número de islotes son necesarios para la eficacia debido a la pobre trasplante siguiente supervivencia. La capacidad de estimular la formación a nivel local red microvascular alrededor de las células encapsuladas pueden aumentar su viabilidad a través de la mejora del transporte de oxígeno, glucosa y otros nutrientes vitales. De crecimiento de fibroblastos factor-1 (FGF-1) es un factor de crecimiento natural que es capaz de estimular la formación de vasos sanguíneos y mejorar los niveles de oxígeno en los tejidos isquémicos. La eficacia de la FGF-1 se incrementa cuando se entrega en una sustla moda ained en lugar de una sola gran bolo de la administración. El local a largo plazo la liberación de factores de crecimiento de los sistemas de encapsulación de los islotes podría estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos directamente a las células trasplantadas, lo que podría mejorar los resultados funcionales del injerto. En este artículo, se describen procedimientos para la preparación de microesferas de alginato para su uso en aplicaciones biomédicas. Además, se describe un método que hemos desarrollado para la generación de microperlas multicapa de alginato. Las células pueden ser encapsulados en el núcleo de alginato interior, y las proteínas angiogénicas en la capa de alginato exterior. La liberación de proteínas a partir de esta capa exterior que estimula la formación de redes locales de microvasculares directamente hacia los islotes trasplantados.
Protocolo
El protocolo aquí se describe un procedimiento en tres fases para la generación de microperlas multicapa de alginato (Figura 1). En primer lugar, microperlas de alginato se forman (Figura 2A). Este procedimiento se describe en la sección 1 de abajo. Las células o proteínas se pueden añadir a las microperlas en este paso con el fin de actuar como un sistema de suministro. El siguiente paso implica la formación de una capa de permeabilidad selectiva sobre las microperlas y se describe en la sección 2. El paso final implica la formación de una capa adicional de alginato y se describe en la sección 3. Esto forma una capa en el exterior de la superficie de las perlas (Figura 2B) se puede utilizar para encapsular y entregar las moléculas terapéuticas (Figura 2C) para dirigir la respuesta celular al trasplante de los siguientes sistemas.
1. Preparación microesferas de alginato
- Preparar una solución al 1,5% (w / v) de LVM alginato disolviendo 15 gramos de alginato MVI en 1 ml decapa interior solución de alginato (25 mM de tampón HEPES, 118 mM de NaCl, 5,6 mM de KCl, y 2,5 mM de MgCl 2 en agua DI, se ajustó a pH 7,4). Mezclar en un vórtice hasta que el poder de alginato ha disuelto completamente para formar una solución transparente y viscoso. Nota: Este protocolo describe las condiciones óptimas para la encapsulación de islotes dentro de microcápsulas de alginato 1 La concentración y la composición del alginato microesferas pueden ser alterados para ajustar las propiedades para otras aplicaciones (por ejemplo, la entrega de drogas, la ingeniería de tejidos, etc). Nota: Para encapsulación islote los islotes se puede añadir a la solución de alginato en este paso previo a la carga en el microencapsulator.
- Preparar la solución de reticulación (22 mM de CaCl 2 en agua DI) por disolución de 100 mM de CaCl 2 y 10 mM de tampón HEPES en agua desionizada y ajustar a pH 7,4. Nota: otros cationes divalentes tales como Br 2 +, Sr 2, etc + puede utilizarse en lugar de Ca 2 +, dependiendo de la naturaleza de la gelificación de alginato deseado.
- Establecer los dos canales de aire chaqueta microencapsulator alginato mediante la adición de una aguja de calibre 25 a una jeringa, y ajustar las válvulas en cada lado para asegurarse de que la aguja está en el centro de la chaqueta de aire. Diferentes agujas de calibre puede ser utilizado para este paso, dependiendo del tamaño de microperlas de alginato dirigidos.
Este paso puede realizarse también con una jeringa, no debe ser un microencapsulator disponible. Añadir la solución de alginato a la jeringa, y seleccionar una aguja de calibre en función del tamaño de microperlas deseados. - Colocar un matraz que contenía 10 ml de solución de reticulación directamente debajo de la aguja. Coloque una barra de agitación en la solución.
- Inyectar gotitas directamente en la solución de CaCl 2 a fin de reticular el alginato para formar microperlas. Incubar las perlas en la solución de reticulación para curar por lo menos quince minutos, con agitación continua.
- Transferir las perlas a un tubo de centrífuga de 15 ml. Retire la solución residual,y llevar a cabo tres lavados con un 0,2% de CaCl 2 en solución salina normal durante dos minutos cada uno.
2. Recubrimiento las microperlas con poli-L-ornitina
- Preparar 3 ml de una solución al 0,1% (w / v) de poli-L-ornitina (OLP) en solución salina normal. Colocar la solución en un vórtice, hasta que se disuelva completamente, formando una solución clara. Poli-L-lisina (PLL) se puede utilizar en lugar de OLP para este paso, que se traduce en niveles similares de permeselectividad.
- Transferencia de las microesferas de alginato en la solución de la OLP. Colocar en un vórtice durante 30 minutos para permitir que el tiempo OLP suficiente para interactuar con el alginato, formando un complejo policatión-polianión. Al final de 30 minutos, debe haber una capa de pintura blanca claramente visible alrededor de las microperlas de alginato.
- Eliminar la solución OLP, y realizar tres lavados con 0,2% de CaCl 2 en solución salina normal durante dos minutos cada uno.
3. Crear el alginato exterior Layer
- Preparar una solución de alginato de concentración deseada que va a ser utilizado para crear la capa exterior. La solución se prepara como se describe en (1,1) por encima. El tamaño de la capa exterior está influenciada por la composición y concentración de alginato utilizado (Figura 3).
- Transferir las microperlas de alginato a una celda-tamiz. Utilizar un Kimwipe para absorber el exceso de solución con el fin de secar las microperlas tanto como sea posible.
- Transferir las microperlas a una superficie Parafilm. Otras superficies lisas tales como vidrio o incluso una placa Petri de plástico puede ser sustituido por Parafilm, si se desea.
- Transferir la solución de alginato preparado en (3,1) en las microperlas de alginato. El volumen de solución de alginato se debe cubrir completamente las microperlas de alginato. Que las microperlas permanecer en la solución de alginato durante 45 minutos.
- Utilizar una pipeta para retirar el exceso de solución de alginato no unido a las microperlas.
- Transferencia de las microesferas en ela una solución de 22 mm de CaCl 2. Este reticula la solución de alginato alrededor de las microperlas, resultando en la formación de la capa de alginato exterior distinta.
- Realizar tres lavados con 22 mM CaCl 2 en solución salina normal durante dos minutos cada uno. Visualización de las microperlas con un microscopio debe permitir una capa de alginato distinto exterior para ser visto formado alrededor de la microperla núcleo.
4. Los resultados representativos
Figura 1. Un esquema del procedimiento para la creación de microperlas multicapa de alginato. Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 2. (A) y (B) son imágenes de contraste de fase de microperlas de alginato. (A) muestra una microperladespués de la síntesis paso (1,7), mientras que (B) muestra una capa distinta alginato exterior presente después de la finalización de la etapa (3,7). (C) es una imagen con FITC de proteína marcada con fluorescencia de BSA encapsulado en la capa exterior. Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 3. El tamaño de la capa exterior de alginato puede ser variado basado en la composición y concentración de alginato utilizado. Nuestros resultados muestran que, tanto para LVM y alginato de LVG, los aumentos de la capa exterior de tamaño con cada vez mayor concentración de alginato, y que el alginato LVG produce gruesas capas exteriores de alginato de LVM en concentraciones iguales. Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre; 95 (2), 632-40 (2010).
Figura 4. Publicación de FGF-1, una proteína del factor de crecimiento angiogénico, desde la capa exterior de alginato variado basado en la concentración de LVM y alginato LVG utilizado. (A) y (B) muestran liberación por ciento, y (C) y (D) denotan la liberación masa correspondiente de FGF-1 frente al tiempo para diferentes formulaciones capa exterior. Hay un comunicado de explosión en todas las condiciones expuestas en la inicial de 5 h (A y C) y bajas dosis de liberación continua durante un máximo de 30 días (B y D). Reproducido con permiso de Khanna et al. J Biomed Mater Res A. noviembre;. 95 (2), 632-40 (2010) Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discusión
El alginato es un polisacárido natural, ácido extraído de las algas y se compone de unidades de 1,4 '-β-D-manurónico ácido (M) y α-L-gulurónico ácido (G) 2,3. Gelificación simple se produce cuando los cationes divalentes, como el Ca 2 +, Sr 2 +, o Ba 2 + interactuar con G-monómeros que forman puentes iónicos entre las cadenas de alginato adyacentes. Microesferas de alginato se han utilizado para ofrecer una variedad de proteínas, incluyendo el crecimiento de fibroblastos f...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por los EE.UU. Departamento de Asuntos de Veteranos (Washington DC), las subvenciones 0852048 y 0731201, y 0854430 de la National Science Foundation (Arlington, VA), y, subvención RO1 DK080897 de los Institutos Nacionales de Salud (Bethesda, MD) . El Sr. Khanna recibido el apoyo de una generosa donación por el Sr. Eduardo Ross y la Dra. Mónica Moya de la Fundación Bill y Melinda Gates (Seattle, WA).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Pronova ultrapura LVG alginato | Nova-Matrix | 4200006 | Una variedad de formulaciones de alginato están disponibles. La elección de alginato influye en las propiedades finales de las microesferas, incluyendo el tamaño, las propiedades mecánicas y de transporte. La composición utilizada debe ser optimizada para una aplicación dada. |
| Pronova ultrapura LVM alginato | Nova-Matrix | 4200206 | Una variedad de formulaciones de alginato están disponibles. La elección de alginato influye en las propiedades finales de las microesferas, incluyendo el tamaño, las propiedades mecánicas y de transporte. La composición utilizada debe ser optimizada para una aplicación dada. |
| Poli-L-ornitina clorhidrato | Sigma-Aldrich | P2533 |
Referencias
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L- Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
- Yamagiwa, K., Kozawa, T., Ohkawa, A. Effects of alginate composition and gelling conditions on diffusional and mechanical properties of calcium-alginate gel beads. J. Chem. Eng. Jpn. 28, 462-467 (1995).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Uriel, S., Brey, E. M., Greisler, H. P. Sustained low levels of fibroblast growth factor-1 promote persistent microvascular network formation. Am. J. Surg. 192, 604-609 (2006).
- Moya, M. L., Lucas, S., Francis-Sedlak, M., Liu, X., Garfinkel, M. R., Huang, J. J., Cheng, M. H., Opara, E. C., Brey, E. M. Sustained delivery of FGF-1 increases vascular density in comparison to bolus administration. Microvasc. Res. 78, 142-147 (2009).
- Moya, M. L., Cheng, M. H., Huang, J. J., Francis-Sedlak, M. E., Kao, S. W., Opara, E. C., Brey, E. M. The effect of FGF-1 loaded alginate microbeads on neovascularization and adipogenesis in a vascular pedicle model of adipose tissue engineering. Biomaterials. 31, 2816-2826 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Greisler, H. P., Opara, E. C., Brey, E. M. Multilayered Microcapsules for the Sustained-Release of Angiogenic Proteins From Encapsulated Cells. Am. J. Surg. 200, 655-658 (2010).
- Khanna, O., Moya, M. L., Opara, E. C., Brey, E. M. Synthesis of multilayered alginate microcapsules for the sustained-release of fibroblast growth factor-1. J. Biomed. Mater. Res. A. 95, 632-640 (2010).
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Reimpresiones y permisos
