Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

Resumen

La citometría de flujo es una poderosa herramienta que permite el aislamiento y estudio de poblaciones celulares específicas. Este protocolo describe los pasos para aislar las células que expresan LacZ de los tejidos cocleares de ratones transgénicos neonatos. Las células cocleares disociadas se marcaron utilizando sustratos conjugados fluorescentes de β-galactosidasa antes de la separación mediante citometría de flujo.

Resumen

El aislamiento de tipos celulares específicos permite analizar poblaciones de células raras como las células madre/progenitoras. Este enfoque para estudiar los tejidos del oído interno presenta un desafío único debido a la escasez de células de interés y a los pocos modelos de ratones reporteros transgénicos. Aquí, describimos un protocolo que utiliza sondas conjugadas con fluorescencia para marcar selectivamente células LacZ-positivas de las cócleas neonatales.

La patología subyacente más común de la pérdida auditiva neurosensorial es el daño irreversible y la pérdida de las células ciliadas sensoriales cocleares, que son necesarias para transducir las ondas sonoras a impulsos neuronales. Evidencias recientes sugieren que los órganos murinos, auditivos y vestibulares albergan células madre/progenitoras que pueden tener potencial regenerativo^1,2. Estos hallazgos justifican una investigación más profunda, incluida la identificación de tipos específicos de células con características de células madre/progenitoras. Se ha demostrado que la vía de señalización Wnt desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de las poblaciones de células madre/progenitoras en varios sistemas^{de órganos 3-7}. Recientemente hemos identificado células que expresan Axin2 que responden a Wnt en la cóclea neonatal, pero su función es en gran medida desconocida⁸.

Para comprender mejor el comportamiento de estas células que responden a Wnt in vitro, hemos desarrollado un método para aislar células que expresan Axin2 de las cócleas de ratones reporteros Axin2-LacZ⁹. Utilizando la citometría de flujo para aislar las células positivas de Axin2-LacZ de las cócleas neonatales, pudimos a su vez ejecutar una variedad de experimentos en células vivas para interrogar su comportamiento como células madre/progenitoras. Aquí, describimos en detalle los pasos para la microdisección de la cóclea neonatal, la disociación de estos tejidos, el marcaje de las células LacZ positivas utilizando un sustrato fluorogénico y la clasificación celular. Se han descrito técnicas para disociar cócleas en células individuales y aislar células cocleares mediante citometría^{de flujo 2,10-12}. Hemos realizado modificaciones a estas técnicas para establecer un protocolo novedoso para aislar las células que expresan LacZ de la cóclea neonatal.

Protocolo

1. Microdisección de la cóclea

1. Prepare el microscopio de disección bajo el capó limpiando las superficies con etanol al 70% y colocando bloques de hielo.
2. Prepare 10-15 placas de Petri de 35 mm en condiciones estériles y llénelas hasta la mitad (~ 2 ml) con una solución salina equilibrada de Hank's con calcio (HBSS) estéril.
3. Prepare dos placas de Petri de 35 mm en condiciones estériles y llénelas hasta la mitad (~2 ml) con 1x solución tamponada de fosfato (PBS) estéril.
4. Esterilizar micropinzas en tubo cónico Falcon de 50 ml con etanol al 70%.
5. En una habitación separada de la campana estéril, use tijeras de iris para decapitar a 12-15 ratones reporteros Axin2^LacZ/+ postnatales (P) de 0-3 días de edad y coloque las cabezas en una placa de Petri de 60 mm sobre un bloque de hielo.
6. Con pinzas Dumont # 5 y tijeras de iris, extirpe la mandíbula y la lengua y corte la base del cráneo a nivel del paladar.
7. Retire la piel suprayacente de la calvaria y seccione la base del cráneo insertando las tijeras en la parte inferior del foramen magnum hasta la mitad del paladar.
8. Realice otra incisión con unas tijeras de iris desde el borde cortado del paladar hasta la cara superior de la pantorrilla en ambos lados, teniendo cuidado de no dañar la cápsula ótica.
9. Aislamiento completo del hueso temporal mediante la realización de dos incisiones en ángulo de 45 grados, partiendo de la cara superior del foramen magnum extendiéndose hasta el corte coronal en el paladar duro.
10. Coloque los huesos temporales aislados en placas de Petri de 35 mm que contengan HBSS en bloque de hielo.
11. Recoge huesos temporales de unos 12-15 animales que han sido sacrificados, para un total de 24-30 huesos temporales.
12. Transfiera la placa de Petri con los huesos temporales aislados a una campana de disección estéril previamente preparada (1.1).
13. Transfiera cuatro huesos temporales a cada placa de Petri de 35 mm preparada previamente que contenga HBSS (1.2) y colóquelos sobre un bloque de hielo.
14. Comience la microdisección con dos pinzas #55 para extirpar suavemente la corteza, el tronco encefálico y el cerebelo en el hueso temporal que recubre la cápsula ótica.
15. Sin retirar la cápsula ótica, separe partes de la cápsula coclear comenzando en la entrada del nervio vestibulococlear en la cápsula ótica.
16. Después de exponer la base de la cóclea, extraiga suavemente la cóclea y los tejidos circundantes. Retire cualquier ganglio espiral restante y la estría vascular comenzando en la base.
17. Transfiera la cóclea a una placa de Petri de 35 mm que contenga PBS en bloque de hielo.
18. Para una viabilidad óptima del tejido, el tiempo total de disección debe ser inferior a 60 min.
19. Repita los pasos anteriores para 3-5 ratones P0-P3 de tipo salvaje (WT) como controles para ratones Axin2-LacZ.

2. Disociación celular (modificado de los métodos descritos anteriormente)^2,10

1. Coloque 50 μl de PBS estéril en el centro de un pocillo en una placa de cultivo no recubierta de 6 pocillos.
2. Transfiera hasta 20 cócleas^{Axin2 LacZ/+} a cada gota de 50 μl de PBS. Se debe utilizar una nueva gota de 50 μl de PBS para más de 20 cócleas.
3. Precalentar 50 μl de alícuotas de tripsina al 0,125% durante ~2 minutos en un baño de agua a 37 °C.
4. Añadir 50 μl de tripsina precalentada al 0,125% al PBS que contiene las cócleas.
5. Coloque el plato de 6 pocillos a 37 °C durante 8 min, teniendo cuidado de no agitar el plato.
6. Para terminar la tripsinización, agregue 50 μl de inhibidor de tripsina de soja a cada gota de 100 μl.
7. Añadir 50 μl adicionales de Full Media (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilina en DMEM/F12)²
8. Con una punta de pipeta roma de 300 μl con un pipeteador p200 ajustado a 125 μl, triture suavemente las células 80 veces, teniendo cuidado de no crear burbujas.
9. Después de la trituración de cada gota, agregue 200 μl adicionales de FM a cada pocillo.
10. Pase las células a través de un filtro de células Falcon azul de 40 μm a un nuevo pocillo.
11. Celdas de transferencia a tubos Falcon FACS estándar (quedan aproximadamente 300 μl después de la trituración y filtración).
    1. Divida las células de las cócleas de tipo salvaje en tres tubos, diluyendo 100 μl con 300 μl de FM en cada tubo. Un tubo se utilizará como control en blanco, otro se tiñirá solo con yoduro de propidio (PI, 1 μg/ml) (no se debe agregar en este paso), mientras que el último se tiñirá con 3-carboxiumbeliferol β-D-galactopiranósido (CUG, ver 2.15) para detectar la fluorescencia de fondo.
    2. Coloque 400 μl de células disociadas de la cóclea Axin2-LacZ en cada tubo FACS. Como control solo de CUG, diluir 10 μl de células en 390 μl de FM (ver tubo F en el paso 2.15). Lleve el volumen de los tubos restantes a 400 μl.
12. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 °C durante 10 min.
13. Prepare la solución CUG:
    1. Prepare 200 μl de CUG para cada tubo de FACS que requiera tinción.
    2. Diluir CUG en FM 1:50 en una capucha oscura con una exposición mínima a la luz.
    3. Precalentar el CUG diluido a 37 °C durante 3-5 minutos.
14. A continuación, añada 200 μl de CUG diluido a cada tubo FACS adecuado. Para los tubos que no están designados para tener CUG, agregue FM solamente (ver 2.15).
15. En esta coyuntura, debe haber cinco categorías de tubos con los siguientes contenidos (no agregue PI en este paso):
    1. Wildtype - sin CUG o PI (para compensación, consulte el paso 3.5-6)
    2. Wildtype - con PI solamente (para compensación)
    3. Wildtype - con CUG y PI (para el control contra las células Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - solo con CUG (para compensación)
    5. Axin2-LacZ - con CUG y PI (para la clasificación real de células)
    6. Axin2-LacZ - con CUG y PI (para análisis de eventos)
16. Proteja todos los tubos de la luz e incube en una incubadora humidificada a 37 °C durante 25 minutos.
17. Prepare una solución fresca de HEPES + suero fetal bovino (FBS) para detener la reacción después de la incubación:
    1. Diluir 400 μl de FBS recién descongelado en 10 ml de HEPES estéril de 10 mM (en PBS) en un tubo Falcon de 15 ml.
    2. Coloque el tubo en hielo hasta completar 2.16.
18. Agregue 1,8 ml de solución HEPES helada a cada tubo FACS debajo de una campana estéril con las luces apagadas para minimizar la exposición a la luz.
19. Centrifugar las celdas a 1200 rpm durante 5 minutos.
20. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 300 μl de FM, agrupar todas las alícuotas de la muestra de clasificación (Axin2-LacZ teñido con CUG y PI).
21. Añadir PI a cada tubo para alcanzar una concentración final de 1 μg/ml.
22. Coloque las células sobre hielo y protéjalas de la luz.

3. Citometría de flujo

1. Utilizamos un BD Aria II equipado con láseres de 488 nm, 633 nm y 407 nm. La detección de CUG se realizó utilizando el láser violeta de 407 nm y PI utilizando el láser azul de 488 nm en las instalaciones FACS compartidas de Stanford.
2. Se requiere un operador de citómetro de flujo capacitado. Continúe con el siguiente paso después de calentar los láseres, calibrar los detectores de citómetros siguiendo las instrucciones del fabricante y configurar los parámetros de clasificación óptimos. En nuestra experiencia, descubrimos que el uso de una boquilla de 100 μm optimiza la viabilidad celular para experimentos posteriores.
3. Se utilizaron los siguientes parámetros: umbral a 5.000 eventos, caudal inferior a 3.000 eventos/segundo, dispersión directa (FSC) a 125 voltios y dispersión lateral (SSC) a 250 voltios, se utilizó el canal PE-Cy5 para PI y Cascade Blue para CUG.
4. Enjuague la cámara del citómetro con etanol al 70% y PBS dos veces cada uno en ese orden.
5. Comience el análisis con células de tipo salvaje sin teñir (tubo A en el paso 2.15). Recopile 1.000 eventos para determinar la distribución de células en la gráfica FSC frente a SSC. Si no se desea la dispersión, ajuste los parámetros FSC y SSC.
6. Realice la compensación utilizando células WT (tubo A) sin teñir, WT teñidas con PI (tubo B) y Axin2-LacZ (tubo D) teñidas con CUG. La compensación permitirá una discriminación de señal más precisa entre las diferentes longitudes de onda del láser.
7. Inicie el análisis con células teñidas de PI y CUG de tipo salvaje (tubo C) y establezca los parámetros de compuerta para:
   1. Exclusión de escombros basada en la gráfica FSC frente a SSC.
   2. Exclusión de dobletes y matorrales utilizando la altura FSC frente a la parcela de área FSC.
   3. Exclusión de células muertas basada en el gráfico de área FSC frente a PE-Cy5 área.
   4. Configure el gráfico del área FSC frente al área azul de Cascade con cualquier ubicación de puerta.
8. A continuación, analice 10.000 eventos del tubo de muestra de clasificación que contiene células teñidas con Axin2-LacZ PI y CUG (tubo F).
   1. Todas las puertas configuradas con celdas de tipo comodín deben aplicarse aquí.
   2. Con gráficos para las celdas de tipo salvaje, cree puertas para las celdas azules de Cascade High que sean inferiores al 1% del número total de eventos.
   3. Estas mismas puertas de Cascade Blue-high ahora abarcan aproximadamente el 15-20% de las células en la muestra de Axin2-LacZ, lo que hace que estas células Axin2-high.
   4. Utilizando el gráfico de análisis de células Axin2-LacZ, cree una puerta para el 15-20% de las células menos fluorogénicas, a partir de ahora células Axin2-low.
9. Sobre la base de la estrategia de compuerta antes mencionada, clasifique las células en tubos FACS que contengan 500 μl de FM, un tubo para las células Axin2-high y el otro para las células Axin2-low. Asegúrese de que los tubos de recolección estén en una cámara enfriada a 4 °C durante la clasificación.
10. Registre el número de células contadas por citómetro de flujo para cada población.

4. Resultados representativos (ver Figura 2):

Con el protocolo anterior, normalmente recuperamos un 40-45% de células libres de residuos tanto de la cóclea de tipo salvaje como de la cóclea^{Axin2 LacZ/+} (Figuras 2A y B), con aproximadamente el 70% de ellas libres de dobletes (ver Figuras 2A' y B'). La mayoría de las celdas clasificadas son viables y no absorbieron PI (~95%) (Figuras 2A'' y B''). En promedio, las células superiores ~20% positivas para CUG se consideran células positivas para Axin2-LacZ (Figura 2B''') y se correlacionan con aproximadamente 15.000 células con un alto contenido de Axin2-LacZ por cada 10-12 animales.

El análisis de reordenamiento por citometría de flujo de células Axin2-high reveló una pureza superior al 93% en el canal Cascade Blue. Con el fin de confirmar aún más la identidad de estas células, realizamos una inmunotinción posterior a la clasificación de las células Axin2-high y Axin2-low utilizando anticuerpos anti-β-galactosidasa, y descubrimos que las células Axin2-high contenían ~93,4% de células β-galactosidasa positivas (más de 1.500 células analizadas) y que las células Axin2-low contenían ~4,8% de células β-galactosidasa positivas.

Figuras y Tablas:

Figura 1.Paradigma experimental. La figura anterior muestra la estrategia y las técnicas experimentales generales tal como se describen en la sección de protocolo. Las cócleas de ratones silvestres y Axin2^LacZ/+ se recolectan y se disocian en células individuales, que luego se trataron con CUG, un sustrato fluorescente para la β-galactosidasa. A continuación, se separaron las células Axin2-LacZ-high y -low mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión a tamaño completo de esta imagen.

Figura 2.Estrategias de compuertas. Esta figura ilustra las estrategias de compuerta de citometría de flujo utilizadas. A) Las células disociadas de tipo salvaje que se sometieron al mismo tratamiento que las células Axin2-LacZ se analizan aquí utilizando un total de 10.000 eventos. El primer panel muestra el área de dispersión lateral (SSC-A) frente al área de dispersión frontal (FSC-A). Aquí, un grupo distinto de eventos es de un tamaño mucho mayor que los eventos más cercanos al eje Y. Estos eventos se designan como "Escombros Negativos". La siguiente puerta, A', analiza las celdas "Negativos de escombros" del panel A, que es el 43,8% del número total de eventos (consulte la tabla a continuación). En este panel, la altura de dispersión directa (FSC-H) frente a la FSC-A se utiliza para excluir dobletes. Se excluyen los eventos que se desvían de la naturaleza lineal esperada de la trama. Esta preparación suele producir eventos de ~70% dentro de la puerta designada, y las celdas restantes se excluyen. En el panel A'', el yoduro de propidio (PI) detectado por el canal PE-Cy5 se utiliza para marcar las células muertas (5,3%). En el siguiente panel (A'''), se utiliza el canal azul de cascada para detectar el sustrato fluorescente CUG. Aquí, las puertas altas de LacZ incluyen menos del 1% del total de eventos. B) Las células disociadas de ratones Axin2-LacZ tratadas con CUG y PI se analizan aquí utilizando un total de 10.000 eventos. Aquí se aplican puertas idénticas del panel A. B' muestra que el 29,5% de las células se excluyen como dobletes, mientras que B' demuestra que el 5,4% no son viables. Las puertas iniciales para las celdas LacZ alta y baja se dibujan utilizando el panel B''' con LacZ-alto inicialmente establecido en 19.7% y LacZ-bajo en 20.4%. Haga clic aquí para ver una versión a tamaño completo de esta imagen.

		Número de evento	porcentaje
un	Análisis de tipo salvaje	10.000
Una'	Negativo de escombros	4.381	43.80%
Una''	Doblete Negativo	3.116	71.10%
Una'''	PI Negativo	2.951	94.70%
	LacZ-alto	16	0.54%
	LacZ-bajo	2.790	94.50%
B	Análisis Axin2-LacZ	10.000
B'	Negativo de escombros	4.218	42.2%
B''	Doblete Negativo	2.973	70.50%
B'''	PI Negativo	2.813	94.6%
	LacZ-alto	553	19.70%
	LacZ-bajo	573	20.40%

Tabla 1. Análisis cuantitativos de las estrategias de compuerta en la Figura 2.

Discusión

Estudios de investigación independientes han caracterizado la capacidad regenerativa limitada dentro de las cócleas neonatales^2,10,12,13. Usando ratones reporteros de GFP y citometría de flujo, White y sus colegas aislaron células cocleares de soporte específicas y encontraron que tenían características de células progenitoras¹².

Se ha demostrado que la vía Wnt canónica marca poblaciones de células madre/progenitoras en múltiples sistemas de órganos, incluidos el cerebro,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri, poliestireno, estéril Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Filtros de células Falcon, estériles, BD Biosciences, azul, 40 μ m	VWR international	21008-949
Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS). Solución con Calcio, Magnesio y sin Rojo de Fenol, Estéril	VWR international	45000-456
Cellstar Tubos de centrífuga, polipropileno, estéril, Greiner Bio-One, 50 ml	VWR international	82050-346
Cellstar Tubos de centrífuga, polipropileno, estériles, Greiner Bio-One, 15 ml	VWR international	82050-278
B-27 Suplemento sin suero (50x), líquido	Invitrogen	17504-044
N-2 Suplemento (100x), líquido	Invitrogen	17502-048
bFGF, factor de crecimiento de fibroblastos-humano básico	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, factor de crecimiento similar a la insulina-1 de ratón	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, factor de crecimiento epidérmico humano	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio/Jamón' s F-12 50/50 Mix: 1X, con L-Glutamina y 15 mM HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Tubos de Fondo Redondo, Desechables, Poliestireno, 12x75	VWR international	60819-295
Tripsina, 0,25% (1X) con EDTA 4Na, líquido	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
Inhibidor de tripsina, Soja, Purificado	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Cell Strainers	BD Biosciences	21008-949
Placas multipocillo, poliestireno, Greiner Bio-One, placas no tratadas, 6 pocillos	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-galactosidasa Kit de detección de beta-galactosidasa	Marker Gene Technologies	M0255