Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.
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Artículo de método
Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra
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Resumen
Resumen
Embrión de pez cebra se convierte en un popular modelo de vertebrados vivo para el estudio de desarrollo cardiaco y las enfermedades del corazón humano, debido a su ventajosa embriología y la genética 1,2. Unos 100-200 embriones están disponibles todas las semanas de un par de peces adultos. Los embriones transparentes que se desarrollan fuera del útero lo hacen ideal para la evaluación de defectos cardíacos 3. La expresión de cualquier gen pueden ser manipulados a través de la tecnología morpholino o ARN de inyección 4. Por otra parte, hacia las pantallas de genética ya han generado una lista de mutantes que afectan a las diferentes perspectivas de la cardiogénesis 5.
Toda la inmunotinción de montaje es una técnica importante en este modelo animal para revelar el patrón de expresión de la proteína dirigida a un determinado tejido 6. Sin embargo, las imágenes de alta resolución que pueden revelar las estructuras celulares o subcelulares han sido difíciles, debido principalmente a la física location del corazón y de la escasa penetración de los anticuerpos.
A continuación, presentamos un método para hacer frente a estos cuellos de botella mediante la disección de corazón y luego llevar a cabo el proceso de tinción de la superficie de un portaobjetos de microscopio. Para evitar la pérdida de las muestras de corazón pequeño y para facilitar el manejo de la solución, que limita las muestras de corazón dentro de un círculo en la superficie del portaobjetos dibujado por una pluma immEdge. Después de la tinción, las señales de fluorescencia puede ser observada directamente por un microscopio compuesto.
Nuestro nuevo método mejora significativamente la penetración de los anticuerpos, ya que un corazón de un pez de embriones sólo se compone de capas de células de unos pocos. Imágenes de alta calidad de los corazones intactos se pueden obtener en un plazo muy reducido para la procesión de embriones de pez cebra edades comprendidas entre los día 2 al día 6. Nuestro método puede ser potencialmente extenderse a otros órganos disecados mancha de cualquiera de pez cebra y otros animales pequeños.
Protocolo
1. Preparación de las placas y cámara húmeda
- La cámara húmeda se puede hacer de una caja como una caja vacía punta. Envuelva tanto la cámara y la tapa con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz.
- Dentro de la cámara, poner un montón de toallas de papel húmedo para mantener la humedad dentro de la cámara, lo que evitará que las muestras de corazón de secado. Establecer una microplaca pequeña en la parte superior de la toalla de papel en un estante para las diapositivas.
- Dibujar líneas o círculos en la superficie de un portaobjetos de microscopio utilizando el lápiz immEdge hacer pozos para las muestras de corazón con una dimensión de 5x5 mm. Deje que los portaobjetos secos.
- Poner los portaobjetos en la cámara húmeda y añadir 50 ul formaldehído fresco 4% en cada pocillo.
2. La disección del corazón embrionario
- Anestesiar a los embriones de pez en el agua de huevo E3 7, que contiene 0,4% tricaína de 1 minuto hasta que el movimiento del cuerpo de peces, pero todavía tienen parada normal del corazónpaliza.
- Ponga un portaobjetos cóncavo en el escenario de un microscopio de disección. Transferir los embriones al pozo cóncavo.
- Ajustar la combinación de la luz del microscopio de disección para revelar claramente el corazón. Dependiendo de la preferencia personal, podría ser cualquiera de campo oscuro o CID-como condición de la luz polarizada.
- Limpiar dos jeringas de insulina con un 75% de etanol, luego se seca.
- Ajustar el microscopio de disección a un aumento mayor y se centran en el corazón. Para fijar físicamente un embrión mediante la inserción de una aguja en el límite con la yema somite cerca de la cabeza. Insertar otra aguja cerca de la región del corazón y tirar el centro hacia fuera rápidamente. Si el corazón no está totalmente separada del embrión, cortar el tejido que ha quedado conectado entre el corazón y la yema.
- Ajustar el microscopio para reducir la ampliación y se centran en el corazón separado. Use un pipetteman 10μl y configurarlo para que el volumen 1μl. Aplicar la punta de la pipetteman Para dibujar o tocar elcorazón de la muestra, de manera que el corazón aislado será dentro o adjunto a la superficie de la punta.
- Sumerja la punta de la pipeta en la solución de formaldehído al 4% en portaobjetos preparados y bajar el pistón de la pipeta para liberar el corazón en la solución. La tensión de la superficie del agua también ayuda a liberar el corazón de la punta de la pipeta a la solución. Con menos del 3 corazones en cada pocillo.
3. Inmunotinción
- Cerrar la cubeta y lo puso en la coctelera con un movimiento de vaivén. Fijar la muestra del corazón durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Limpie el agua en la parte posterior de las diapositivas y poner las diapositivas en el escenario de un microscopio de disección para el intercambio de buffer.
- Que moje la punta de un pipetteman 10μl en una región vacía en cada pozo y mantener la punta de la medida de lo posible a partir de muestras de corazón. Tomar precauciones para evitar que el corazón inherentes a la punta, ya que los corazones puedan moverse con el flujo de agua cuando la solución se introduce en la punta. Cambiola localización de la punta, si es necesario.
- Deseche la solución en un pañuelo y evitar la producción de las burbujas en la punta ya que la muestra del corazón se pierde fácilmente en la presencia de burbujas de aire. Mantener las muestras de corazón parcialmente seco por un corto tiempo puede ayudar a los corazones de permanecer conectados a las diapositivas.
- Añadir 50μl PBST para cubrir la muestra y se incuba en el corazón de la cámara húmeda en un movimiento de balanceo lento durante 5 minutos. Repita el enjuague una vez más. Después de este paso, las muestras del corazón pueden ser almacenados en la cámara húmeda hasta 1 semana a 4 ° C.
- Bloque de la muestra de corazón con suero de oveja 10% en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Incubar la muestra de corazón con los anticuerpos primarios, tales como dilución 1:200 de la β-catenina de anticuerpos y la dilución 1:200 de MEF2 anticuerpo específico, en el 10% suero de oveja / PBST durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar la muestra con el corazón PBST tres veces (5 min. Cada uno) a temperatura ambiente.
- Incubar la muestra con la secundariaanticuerpos, tales como dilución 1:1000 de Alexa-etiquetados anti-ratón y / o anticuerpos anti-conejo, en PBST durante 0,5 horas.
- Lavado de las muestras de corazón con PBST tres veces (5 min. Cada uno) a temperatura ambiente.
4. Imágenes
- Quitar PBST y se añaden 10 l medio de montaje en cada pocillo. Rocas de la cámara durante varios minutos hasta que la solución se aclare.
- Eliminar la mayor parte del medio de montaje y cubrir todos los pozos en una diapositiva con una cubierta de cristal de microscopio (24x50).
- Corazón la imagen de peces utilizando Zeiss Axioplan 2 microscopio equipado con ApoTome (Carl Zeiss).
5. Resultados representante
Un ejemplo de una imagen que revela la membrana y el núcleo de todos los cardiomiocitos del pez cebra se muestra en la fig. 1. anticuerpos MEF2C y β-catenina se utiliza junto a manchar las muestras de corazón disecado de 52 HPF embrión de pez cebra. Mientras que las manchas de MEF2C anticuerpos de los núcleos de cardiomiocitos, β-cateninaanticuerpos revela el borde de cada celda de 8.10. Mediante el ajuste de la platina del microscopio compuesto, las imágenes de las muestras de corazón se puede ajustar a la misma orientación, lo que permitirá la observación de la curvatura exterior y la curvatura interna en el corazón 11. El número de cardiomiocitos total, tamaño de la celda de cardiomiocitos, y la circularidad se puede medir.
Otro ejemplo que revela la estructura del sarcómero de un corazón embrionario se muestra en la fig. 2. Se realizó inmunotinción con F59, un anticuerpo miosina, en un corazón disecado embrionarias. La red de miofibrillas en el corazón embrionario completo puede ser revelado claramente a un menor aumento, mientras que la banda estriada del filamento grueso se puede revelar a mayor aumento (Fig. 2) 6.
Figura 1. Inmunotinción de MEF2 (rojo) y β-catenina (verde) para mostrar los núcleos y outlines de los cardiomiocitos en un ventrículo del pez cebra. Barra de escala = 10μm
Figura 2. Immnostaining de la miosina para mostrar el filamento grueso en un ventrículo del pez cebra en cualquiera de bajo aumento (A) o aumento (B). Barra de escala = 10μm
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Discusión
En comparación con los métodos clásicos de todo el montaje inmunoticción, nuestro método tiene las siguientes ventajas. En primer lugar, mucho más fuertes señales fluorescentes pueden ser obtenidos consistentemente, debido a una mejor penetración. En el método de tinción de montaje conjunto, el denso tejido de la piel que rodea el corazón reduce significativamente la penetración de muchos anticuerpos, lo que resulta en el fondo de alto en todo el cuerpo. Este problema es especialmente grave para los embriones de más de ...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Beninio Jomok por su ayuda en la cría de pez cebra. Este trabajo está financiado por el NIH HL81753.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| tricaína | Orgánicos de investigación | 3007T | |
| Formaldehído | Polysciences | 04018 | |
| La insulina jeringa | Becton Dickinson | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma | T8532 | |
| Anti-β-catenina de anticuerpos | Sigma | C7207 | |
| Anticuerpos anti-MEF2C | Santa Cruz Biotech | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinina anticuerpos | Sigma | A7811 | |
| Anticuerpo anti-calaña | Señalización celular | # 3862 | |
| Alexa Fluor 568 cabra anti IgG de conejo td> | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa Fluor 488 cabra anti IgG1 de ratón | Invitrogen | A21121 | |
| Medio de montaje para fluorescencia | Vector | H-1200 | |
| ImmEdge pluma | Vector | H-4000 | |
| Poli-L-lisina portaobjetos recubiertos | Electrónica de ciencias de la microscopía | 63410-01 | |
| Microscopio cubierta de vidrio | Pescador | 12 a 543-D | |
| Diapositivas cóncavo microscopio | Pescador | 7-1305-8 | |
| Disección microscopio | Leica MZ95 | ||
| Compuesto microscopio | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0,5% Triton X-100
400 mg tricaína
97.9 mL ddH2O
2,1 ml (1M Tris pH 9)
Ajustar el pH a 7.0
Referencias
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- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
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Reimpresiones y permisos
