Seguimiento de señalización dentro de los agregados de células hipóxicas encapsulado

Summary

Un método para la foto-encapsulación de células en un hidrogel de PEG reticulado se describe. Señalización de hipoxia en insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados se realiza un seguimiento mediante un sistema de marcadores fluorescentes. Este sistema permite el examen de serie de células dentro de un hidrogel de andamios y la correlación de las señales de hipoxia con los cambios en el fenotipo celular.

Abstract

En la diabetes mellitus tipo 1, la destrucción autoinmune de las células β pancreáticas resulta en pérdida de la producción de insulina e hiperglucemia potencialmente letal. Como opción de tratamiento alternativa a la inyección exógena de insulina, se ha explorado el trasplante de tejido pancreático funcional^1,2. Este enfoque ofrece la promesa de una restauración más natural y a largo plazo de la normoglucemia. La protección del tejido del donante del sistema inmunitario del huésped es necesaria para evitar el rechazo, y la encapsulación es un método utilizado para ayudar a lograr este objetivo.

Los materiales de origen biológico, como el alginato³ y la agarosa⁴, han sido la elección tradicional para la construcción de cápsulas, pero pueden inducir inflamación o sobrecrecimiento fibrótico⁵ que puede impedir el transporte de nutrientes y oxígeno. Alternativamente, los hidrogeles sintéticos a base de poli(etilenglicol) (PEG) no se degradan, se funcionalizan fácilmente, están disponibles en alta pureza, tienen un tamaño de poro controlable y son extremadamente ^{biocompatibles,6,7,8}. Como beneficio adicional, los hidrogeles PEG pueden formarse rápidamente en una simple reacción de foto-reticulación que no requiere la aplicación de temperaturas no fisiológicas^6,7. Este procedimiento se describe a continuación. En la reacción de reticulación, la degradación UV del fotoiniciador, 1-[4-(2-hidroxietoxi)-fenil]-2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-ona (Irgacure 2959), produce radicales libres que atacan los dobles enlaces de vinilo-carbono-carbono del PEG dimetacrilato (PEGDM) induciendo la reticulación en los extremos de la cadena. La reticulación se puede lograr en 10 minutos. Se ha demostrado que los hidrogeles PEG construidos de esta manera apoyan favorablemente las células^7,9, y la baja concentración del fotoiniciador y la breve exposición a la irradiación UV no son perjudiciales para la viabilidad y la función del tejido encapsulado¹⁰. Si bien metacrilatamos nuestro PEG con el método que se describe a continuación, el PEGDM también se puede comprar directamente a proveedores como Sigma.

Una consecuencia inherente de la encapsulación es el aislamiento de las células de una red vascular. Por lo tanto, el suministro de nutrientes, en particular oxígeno, se reduce y limita por difusión. Esta disponibilidad reducida de oxígeno puede afectar especialmente a las células β cuya función secretora de insulina depende en gran medida del oxígeno^11-13. La composición y la geometría de la cápsula también influirán en las tasas de difusión y las longitudes del oxígeno. Por lo tanto, también describimos una técnica para identificar células hipóxicas dentro de nuestras cápsulas de PEG. La infección de las células con un adenovirus recombinante permite producir una señal fluorescente cuando se activan las vías del factor inducible por hipoxia intracelular (HIF)¹⁴. Dado que los HIF son los principales reguladores de la respuesta transcripcional a la hipoxia, representan un marcador diana ideal para la detección de la señalización hipóxica¹⁵. Este enfoque permite una detección fácil y rápida de células hipóxicas. En resumen, el adenovirus tiene la secuencia de una proteína fluorescente roja (Ds Red DR de Clontech) bajo el control de un trímero de elemento sensible a la hipoxia (HRE). La estabilización de HIF-1 en condiciones de bajo oxígeno impulsará la transcripción de la proteína fluorescente (Figura 1). Anteriormente se han publicado detalles adicionales sobre la construcción de este virus¹⁵. El virus se almacena en glicerol al 10% a -80 °C hasta alícuotas de 150 μL en tubos de centrífuga de 1,5 mL a una concentración de 3,4 x^{10 10} pfu/mL.

Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que las células MIN6 encapsuladas como agregados mantienen su viabilidad a lo largo de 4 semanas de cultivo en un 20% de oxígeno. Los agregados de MIN6 cultivados con 2 o 1% de oxígeno mostraron signos de células necróticas (todavía viables en un 85-90%) por tinción con bromuro de etidio, así como cambios morfológicos en relación con las células con 20% de oxígeno. La forma esférica suave de los agregados mostrados al 20% se perdió y los agregados aparecieron más como grupos desorganizados de celdas. Si bien el bajo estrés por oxígeno no causa una caída pronunciada en la viabilidad, está claramente afectando la agregación y la función de MIN6 según lo medido por la secreción de insulina estimulada por glucosa¹⁵. El análisis de Western blot de células encapsuladas en oxígeno al 20% y al 1% también mostró un aumento significativo de HIF-1α para las células cultivadas en condiciones de bajo oxígeno, lo que se correlaciona con la expresión de la proteína DsRed DR.

Protocol

1. PEGDM síntesis y PEGDM fotoactivos preparación de la solución de macrómero

1. Pesar 2 g de PEG (lineal, 10.000 Da) en un vial de vidrio de 40 ml con una tapa de plástico duro.
2. Añadir aproximadamente 308μL de anhídrido metacrílico y libremente tapa del frasco.
3. Microondas en el vial de alto por 2 minutos en un horno de microondas doméstico estándar. El uso de guantes resistentes al calor, a fondo vórtice del vial, a continuación, microondas a máxima potencia durante 5 minutos.
4. En pocas palabras permiten al vial que se enfríe lo suficiente como para ser manejados con guantes. Destape y agregue lentamente que el cloruro de metileno, mientras que hace girar el vial. Agregar suficiente para que la solución parece clara y homogénea, agitación de la muestra, según sea necesario. El volumen total de cloruro de metileno utilizado debe ser de 1,5 - 2 ml.
5. PEGDM precipitado en 200 ml de frío, se agita éter dietílico mediante la adición de la solución gota a gota.
6. Recoge los PEGDM por filtración al vacío y deje que se seque.
7. Disolver el PEGDM en una cantidad adecuadade agua desionizada (típicamente 100 a 150 ml).
8. La solución de diálisis contra agua desionizada durante 5 días en tubos de diálisis con un peso molecular de corte de 1000 Da. Reemplazar el agua una vez al día.
9. Alícuota de la solución en recipientes adecuados y se congelan a -80 ° C durante la noche. Liofilizar la solución durante 4 días para producir un polvo blanco PEGDM purificada. Guarde el polvo a 4 ° C cuando no se utiliza.
10. Para preparar una solución PEGDM fotoactivos, en primer lugar elaborar un 0,5 por ciento en peso fotoiniciador solución madre disolviendo Irgacure 2959 en agua desionizada. Vortex la solución y guardarla en la oscuridad.
11. Prepare una PEGDM 10% en peso y 0,025% en peso de 2959 Irgacure solución en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Vortex a fondo para asegurar la disolución de la PEGDM. Nos suelen preparar 1 ml de esta solución a la vez.
12. Esterilizar la solución por filtrado a través de un filtro de 0,2 micras de la jeringa en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. Envuelva el tubo con papel de aluminioy se almacena a 4 ° C

2. La cultura, la infección, y la agregación de células MIN6

1. MIN6 células se cultivan en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%, la glucosa de 7 mm, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina y 0,5 mg / mL anfotericina B en un ambiente humidificado a 37 º C y 5% CO _2.
2. Para liberar las células de la superficie de cultivo tratada frasco, aspire el medio, lavar las células con 37 ° C de calcio / magnesio libre de HBSS, aspirar el HBSS, a continuación, agregar 2 ml de 37 ° C con tripsina-EDTA y permitir que las células incubar durante 3 minutos.
3. Jar firmemente del lado de la botella para golpear a las células libres, y se añaden 8 ml de 37 º C y la media pipeta vigorosamente la suspensión celular arriba y hacia abajo con cuidado de no introducir burbujas.
4. Pipeta las células en un tubo de centrífuga estéril 15 ml y llevar a cabo un recuento de células utilizando un hemocitómetro o celulares contar procedimiento.
5. En la preparación para infectar las células con el fabricantevirus, primero se determina el número total de células que están infectadas y calcular el volumen de suspensión de virus necesaria para lograr la multiplicidad deseado de infección (MOI) (50 a 100 partículas infecciosas por célula).
6. Diluir el virus en HBSS cuidadosamente pipeta la cantidad apropiada de suspensión de virus en un volumen pre-alícuotas de HBSS en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. 50 l de HBSS por pocillo de células de agregación es la adecuada.
7. Dispersar las células por la pipeta hacia arriba y hacia abajo en su tubo, pipeta el volumen necesario para alcanzar 400.000 células por pocillo en los pocillos de una placa de suspensión de 6 pocillos.
8. Añadir la cantidad apropiada de virus diluido a cada pocillo para lograr el deseado momento de inercia.
9. Añadir a cada pocillo medio para llevar el volumen total de hasta 1,7 ml.
10. Colocar la placa en un agitador orbital dentro de la incubadora. Establecer la coctelera en un nivel bajo para que el medio lava suavemente alrededor de los pozos (~ 100 rpm). Permitir que las células de la agregaciónte de 24 a 36 horas. Agregados con un diámetro aproximado de 75 a 175 micras deben ser formados.

3. La encapsulación de células en PEGDM

1. Las células pueden ser encapsulados en forma de dispersión (paso 2.4) o la agregación siguiente (paso 2,10). Desde el precursor de hidrogel PEGDM solución es un líquido, las células tienden a establecerse antes de la reticulación y la formación del hidrogel. Si la liquidación se espera que ocurra rápidamente, por ejemplo, con agregados de mayor tamaño, puede ser beneficioso para producir el hidrogel en dos pasos para que las células se depositan en un plano central del gel. Un procedimiento de hidrogel de una etapa de síntesis adecuada de las células dispersas se muestra (Figura 2) y el procedimiento de dos pasos se muestra así (Figura 3) y se detallan a continuación (3.2-3.9).
2. Crear un recipiente en el que será el hidrogel formado por el corte de la punta cónica de una jeringa de plástico de 1 ml y colocarlo abertura hacia arriba en un estante.
3. Pipetear 20 L de PEGDM fotoactivos paralución en el extremo abierto de la jeringa sobre el émbolo de asegurarse de que el volumen cubre toda la superficie del émbolo. Ajustar el émbolo en pequeños incrementos hasta conseguir una superficie plana de líquido.
4. Coloque la pipeta en el soporte y la posición de la parrilla por debajo de una lámpara UV (365nm, ~ 7 mW / cm ²⁾ durante aproximadamente 8 minutos para permitir que para el entrecruzamiento del hidrogel. Durante este tiempo, la preparación de las células puede ser iniciado
5. Pipeta un volumen que contiene el número deseado de células / agregados en un tubo de microcentrífuga de 1,8 mL, la tapa y centrifugar el tubo a 130 g durante 5 minutos.
6. Utilizando una micropipeta, retirar con cuidado los medios de comunicación sin perturbar el sedimento celular en la punta del tubo. A medida que la cabeza se aproxima a la media pastilla, puede ser útil usar una más fina, punta de la pipeta 10 mL.
7. Suavemente resuspender el botón celular en 20 l de solución de fotoactivos PEGDM (use una punta de pipeta de boca ancha, si se trabaja con agregados) y añadir la suspensión celular a la jeringa en la parte superior de the previamente reticulado parte de hidrogel.
8. Exponer la jeringa a un adicional de 8 minutos de luz UV para completar la construcción del hidrogel. Cuando haya terminado, las células deben estar completamente encapsulado dentro del hidrogel cilíndrico (Figura 3).
9. Expulsar el hidrogel de la jeringa y en 1 ml de HBSS en el pozo de una placa de 24 pozos para lavar brevemente el gel. Transferir el gel a 1 ml de los medios de comunicación en el pozo de una placa de 24 pozos y la cultura en las condiciones deseadas.

4. El seguimiento de la hipoxia

1. En cualquier momento de la cultura, la imagen de las células mediante microscopía de fluorescencia para rastrear el inicio de la señalización de la hipoxia. Dependiendo de lo que se va a examinar se puede la imagen de la placa multi-bien o transferir el gel a un portaobjetos de microscopio antes de colocarlo en la platina del microscopio. Pico de excitación Ds Red se logra a 556nm y emisión máxima se produce a 586nm. Emisión es bastante intenso y por lo tanto no ha sido photobleaching observadoresed a ser problemático. Tiempo de retraso entre el inicio de la producción de proteínas y la detección de la primera señal es de aproximadamente 12 horas. La señal es lo suficientemente específico para identificar las células individuales de la señalización, pero la resolución puede ser insuficiente para determinar la localización intracelular de la señal. En las células de señalización, señales que normalmente se observa de manera uniforme por todo el citoplasma. Intensidad de la señal también puede aumentar con la exposición prolongada a la hipoxia, a pesar de que aún no han determinado si esto se debe al aumento de expresión de la proteína, la acumulación de proteínas en general, o proteínas de maduración retardada.

5. Los resultados representativos

Un ejemplo representativo de MIN6 agregados encapsulados en un hidrogel de PEG se muestra en la Figura 4. El gel reticulado será sólida en todo, tomando la forma del recipiente en el que se llevó a cabo la reacción. Un gel con suaves superficies exteriores es preferible para la implantación de la ayuda en la prevención de un nuevo cuerpo extrañorespuesta. En el gel, los agregados de células deberían estar totalmente cerradas en la matriz y homogéneamente distribuidos para permitir un mejor transporte de nutrientes.

Imágenes representativas de la señalización de hipoxia en MIN6 agregados se muestran en la Figura 5. Idéntica MIN6 agregados infectados con el virus marcador fueron cultivadas en un 20% de O ₂ (5 bis) o el 1% de O ₂ (5b) durante 44 horas antes de la captura de imágenes.

Figura 1. Esquema de la actividad de nuestro sistema de marcador de hipoxia. Inserción adenoviral de la Ds Red DR gen promotor aguas arriba y educación en derechos humanos permite la hipoxia inducida por la producción de la proteína fluorescente bajo el control de HIF-1.

Figura 2. Diagrama de flujo del procedimiento para la encapsulación de un solo paso de la dispersión de las células en un MIN6 crosslinked hidrogel PEGDM. Para cada gel, las células dispersas se suspenden en 40μL de la solución de macrómero fotoactivos PEGDM. Este se coloca en una jeringa de 1 ml y decapitado el hidrogel se forma bajo la luz UV 365 nm después de 10-12 minutos. Una vez terminado, el disco de hidrogel se retira la jeringa, se lavan y se colocan en un plato y medio llena de incubación.

Figura 3. Diagrama de flujo del procedimiento para la encapsulación de doble paso de agregados de células MIN6 en un hidrogel reticulado PEGDM. Para cada gel, medio-gel se formó por primera vez por reticulación UV de 20μL de la solución de macrómero fotoactivos PEGDM durante 8 minutos. MIN6 agregados son cuidadosamente suspendidos en una solución adicional de 20μL fotoactivos macrómero que se añade en la parte superior de la pre-formados semi-gel. El gel completo está formado por un adicional de 8 minutos de exposición UV con agregados encapsulados en el medioplano de la gel.

Figura 4. Imagen de un hidrogel de 40μL en 20X. MIN6 agregados (~ 400.000 células totales) se ven claramente en el gel. Diámetro es de aproximadamente 6 mm de hidrogel (barra = 1 mm).

Hipoxia Figura 5. Fluorescentes de señalización en las células MIN6 agregados en un hidrogel PEGDM. Las células que se concentraron y se coloca en la incubación a 20% de O ₂ durante 44 horas no muestran señales de hipoxia (a) mientras que las células que se concentraron luego incubadas en el 2% de O ₂ por 44 horas de visualización de la señal clara, en todas partes. (Barra = 100μm) (b).

Discussion

El método que aquí se presenta ofrece una técnica rápida y sencilla para la encapsulación de células en un hidrogel de PEG con un uso mínimo de condiciones no fisiológicas. PEG representa un material de encapsulación de gran utilidad para su biocompatibilidad y facilidad de modificación. Simple variación del porcentaje de PEG en la solución de fotoactivos, por ejemplo, se puede utilizar para ajustar las propiedades mecánicas, como el módulo de compresión, y las propiedades de transporte a través del tamaño de los poros. Además, el PEG es fácil de modificar por la adición de cadenas laterales. Hidrogeles de PEG, por lo tanto, representan tanto un dispositivo prometedor clínica y una plataforma flexible para la investigación in vitro

Un método para el seguimiento de la hipoxia en las células encapsuladas PEG-También se ha presentado. Este método es útil para la simplicidad de la detección de la hipoxia y para evitar la necesidad de sacrificar las células de interés. La técnica se puede aplicar a una variedad de tipos de células en una variedad de condiciones lo que nos de suefulness amplio. Por ejemplo, la hipoxia como señal para la diferenciación de células madre puede ser rastreado en las culturas madre micromasa celular. Sin embargo, este método sólo puede aplicarse a sistemas dispersos de células o sistema en el que dispersa las células son luego agregados. Además, la detección de la señal fluorescente puede ser difícil en los tejidos más grandes o más densas.

Materials

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
El anhídrido metacrílico	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Microonda	Emerson	MW8784SB
Vórtice	Scientific Industries	SI-A236
Cloruro de metileno	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Éter dietílico	Sigma-Aldrich	346136-1L
Tubo de diálisis	Espectro	132640
	Laboratorios
Congelador
Liofilizador	Labconco	7670521
Bomba de vacío	Welch	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21 a 022 CV
Filtro de jeringa	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Formulación personalizada
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicilina-estreptomicina	Mediatech	30 a 002-CI
Anfotericina B	Mediatech	30 a 003-CF
Incubadora	Thermo Scientific	3597	Napco Series 8000 WJ w / O2 supresión
Tripsina EDTA	Mediatech	25 a 052-CI
Agitador orbital	VWR	12620-926
Lámpara UV	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Tiene dos 40W, 365nm bombillas de luz negra azul UV
Centrífugo	Eppendorf	5811 000.010 *	* El número de orden. Modelo 5810 R
Microscopio	Nikon	TI-ND6-PFS	Con filterset para la excitación de 556nm / 586nm de emisión