Las fuerzas mecánicas juegan un papel clave en el desarrollo pulmonar y lesión pulmonar. A continuación, describimos un método para aislar roedores pulmonares fetales células tipo II epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica mediante un In vitro Sistema.
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Artículo de método
Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fuerzas mecánicas generadas en el útero por la repetición como la respiración, los movimientos y por la distensión del fluido son fundamentales para el desarrollo normal de los pulmones. Un componente clave del desarrollo de los pulmones es la diferenciación de las células alveolares de tipo II epiteliales, la principal fuente de surfactante pulmonar. Estas células también participan en la homeostasis de los líquidos en la luz alveolar, la defensa del huésped, y la reparación de lesiones. Además, las células del parénquima pulmonar distal puede estar directamente expuestos a la extensión exagerada durante la ventilación mecánica después del nacimiento. Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares mediante el cual las células pulmonares detectan los estímulos mecánicos para influir en el desarrollo pulmonar y promover la lesión pulmonar no se conocen. Aquí, se proporciona un método simple y de alta pureza para aislar las células de tipo II y fibroblastos de pulmón fetal de roedores. A continuación, se describe un sistema in vitro, la Unidad de tensión Flexcell, para proporcionar la estimulación mecánica de las células fetales, simulando las fuerzas mecánicas deel desarrollo pulmonar fetal o lesión pulmonar. Este sistema experimental constituye una excelente herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares en las células del pulmón fetal expuestos a estirar. Con este enfoque, nuestro laboratorio ha identificado varios receptores y las proteínas de señalización que participan en mecanotransducción en el desarrollo pulmonar fetal y la lesión pulmonar.
Protocolo
1. El recubrimiento de placas con las proteínas ECM
- En condiciones estériles, mezclar 120 g de laminina con 12 ml de PBS estéril 1X frío por placa.
- Tomar Bioflex placas sin tratar y añadir 2 ml de la solución a cada pocillo (concentración final de laminina es 2 mg / cm 2). Alternativamente, otras proteínas ECM podrían ser utilizados, tales como colágeno-1 [10 g / cm 2], la fibronectina [5 g / cm 2], vitronectina [0,5 g / cm 2] o elastina [10 g / cm 2]. La técnica de revestimiento es similar a lo que se ha descrito para laminina-recubrimiento. Asegúrese de que los pozos están completamente cub....
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Discusión
En este manuscrito, se describe un método para aislar células tipo II fetales epiteliales y fibroblastos y exponerlos a la estimulación mecánica utilizando el aparato de tensión Flexcell. Hemos utilizado esta técnica para evaluar la diferenciación de las células epiteliales 1,2 y el estudio de los receptores y las vías de señalización activadas por tramo 3-9. Además, este método también se puede utilizar para investigar las respuestas de células inducidas por lesión mecánica 10,11. El pr.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Apoyado por el NIH subvención HD052670.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Colagenasa 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Colagenasa 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Suero de pollo | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Copas de tamizado | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Filtros de jeringa | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| Malla de nailon de 100 micrones | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| Malla de 30 micrones | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| Malla de 15 micrones | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminina | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Colágeno-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectina | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastina | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Placa Bioflex | Flexcell International | BF-3001U | Sin recubrir |
| Unidad de tensión Flexcell | Flexcell International | FX-5000 |
Referencias
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P.
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Reimpresiones y permisos
