Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.
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Artículo de método
Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina
En este artículo
Resumen
Resumen
Progranulina (PGRN), también conocido como precursor granulina epithelin (GEP), es un factor de crecimiento autocrino 593-amino-ácido. PGRN se sabe que juega un papel crítico en una variedad de procesos fisiológicos y enfermedades, incluyendo principios de la embriogénesis, cicatrización de heridas 1, la inflamación 2, 3 y 4 de defensa del huésped. PGRN también funciona como un factor neurotrófico 5, y las mutaciones en el gen PGRN resultando en la pérdida parcial de la demencia frontotemporal causa PGRN proteínas 6, 7. Nuestros estudios recientes han conducido al aislamiento de PGRN como un importante regulador del desarrollo del cartílago y la degradación de 8-11. A pesar de PGRN, descubierto hace casi dos décadas, juega un papel crucial en varias condiciones fisiológicas y patológicas, los esfuerzos para aprovechar las acciones de PGRN y entender los mecanismos implicados han sido considerablemente obstaculizada por nuestra incapacidad para identificar su unión al receptor (s). Para solucionar este problema, hemos desarrollado una modiFIED dos híbridos de levadura (MY2H) enfoque basado en el más utilizado GAL4 basada en dos sistema híbrido. En comparación con la levadura convencional de dos híbridos de pantalla, MY2H reduce drásticamente el proceso de la pantalla y reduce el número de falsos positivos clones. Además, este método es reproducible y confiable, y hemos empleado con éxito este sistema en el aislamiento de las proteínas de unión de diversos cebos, incluidos los canales de iones 12, proteína de la matriz extracelular 10, 13, 14 y factor de crecimiento. En este trabajo se describe el procedimiento experimental MY2H en detalle utilizando PGRN como ejemplo, que condujo a la identificación de TNFR2 como el primero conocido PGRN asociada a los receptores 14, 15.
Protocolo
1. Información general
La levadura de dos sistema híbrido es una poderosa técnica genética utilizada para descubrir las interacciones proteína-16, 17. Varias clases de dos híbridos de sistemas, tales como la serie LEXA-los sistemas basados en el sistema de contratación Sos, y las bacterias o células de mamíferos base-2-híbridos, son comerciales disponibles, en este documento se centra específicamente en las modificaciones de las más utilizadas GAL4 base levadura de dos sistema híbrido. En resumen, el método se basa en las propiedades de la proteína GAL4 de levadura, que consiste en separar los dominios responsables de ....
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Discusión
Levadura de dos híbridos de cribado ha demostrado ser una herramienta eficaz en la identificación de la interacción de proteínas 16, 17. En comparación con otros métodos para la identificación de la proteína de unión de la pareja, tales como la purificación bioquímica de proteínas y co-chips, dos híbridos de levadura es un enfoque sensible genética que puede ser utilizado para la detección de un número muy alto de las secuencias codificadoras de un experimento relativamente sencillo, en Además, se detecta la .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones para la investigación K01AR053210, R01AR061484 y una beca de la Fundación Nacional de Psoriasis.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| ProQuest sistema híbrido de dos | Invitrogen | 10835 | |
| YPD medio de crecimiento | Clontech | 630409 | |
| YPD medio Agar | Clontech | 630410 | |
| Mínimo SD Base de agar | Clontech | 630412 | |
| -Leu se complementa | Clontech | 630414 | |
| -Leu/-Trp Se complementa | Clontech | 630417 | |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura Se complementa | Clontech | 630425 | |
| 3-amino-1 ,2,4-triazol (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | |
| Caldo Luria (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 | |
| Salmón sonicado ADN de los espermatozoides | Stratagene | 201190 | |
| Ampicilina | Amresco | 0339 | |
| Kanamicina sulfato | Invitrogen | 11815-024 | |
| Eficiencia subclonación ™ ™ DH5a células competentes | Invitrogen | 18265-017 | |
| Trizma ® base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Acetato de litio | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Sigma-Aldrich | ED | |
| Membrana de nitrocelulosa | Bio-Rad | 162-0115 | |
| 10 cm de una caja de petri | ITI Científico | CT-903 | |
| Incubadora (30 ° C) | ATR (Ecotron) |
Referencias
- He, Z. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Kessenbrock, K. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatory progranulin. J. Clin. Invest. 118
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Reimpresiones y permisos
