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1. La construcción de la Microdrive
Todas las unidades que están hechos de los mismos elementos básicos: una parte móvil, que lleva el electrodo y una parte fija, que está anclada en el cráneo. Un microdrive ideal permite suficiente recorrido suave pero largo del electrodo en múltiples pasos pequeños, es lo suficientemente resistente como para impedir el movimiento accidental del electrodo, fácil de manipular por el experimentador sin interferir con el comportamiento del animal, de tamaño pequeño y ligero de peso. Como resultado de estos requisitos en conflicto, conjunto de unidades de diferente diferentes aplicaciones.
Sólo 4 partes son necesarias para construir nuestra unidad básica: un tornillo de latón de cabeza plana, una tuerca de juego, un puente de plástico preparado a partir de un encabezado de fila único punto de conexión y dos cortados a planchas de bronce.
- Romper una pieza de 3 pines de la cabecera
- Retire con cuidado el pin central.
- Ampliar el agujero de perforación a través de él con un tamaño de broca # 55.
- Cortar una ªleer usando la llave de 00-90.
- Corte dos piezas de la placa de bronce.
- Presente los bordes de las placas con una dremmel.
- Haga un agujero en el medio de ambas piezas con un tamaño de broca # 65.
- Montar las piezas de accionamiento de manera que las placas de latón se toquen las clavijas. Para ello, inserte el tornillo de bronce a través de, sucesivamente, la placa de bronce, el orificio roscado de cabecera, la segunda placa de bronce, y la tuerca. Apretar el tornillo suavemente de modo que el conjunto se vuelve estable.
- Soldar el pin termina a las planchas de bronce.
- Presente el extremo saliente del tornillo.
- Soldadura de la tuerca en el tornillo. Tenga cuidado de no suelde la tuerca a la placa de bronce.
- Pon a prueba el movimiento de la unidad: girar el tornillo de las agujas del reloj para elevar el puente de plástico.
2. Preparación de la sonda de silicio
Antes de fijar la sonda a la unidad, agregar aislamiento extra a la zona de unión de la sonda para evitar cerebrospinal líquido cefalorraquídeo (LCR) o la humedad de la producción de cortocircuitos:
- Pesar y mezclar los componentes de elastómero Sylgard en una proporción de 10:1.
- El uso de un aplicador de algodón afilada, aplicar el Sylgard al extremo superior de la sonda.
- Que se seca en un horno precalentado a 60 ° C durante 2 horas.
Para asegurarse de que los sitios de registro están desprovistos de cualquier residuo, las puntas de las sondas se deben limpiar:
- Prepare una dilución del 4% de detergente Contrad.
- Que la sonda en remojo en el detergente a 63 ° C durante al menos 2 horas.
- Enjuagar el detergente fuera por inmersión de la sonda repetidamente en agua destilada.
Antes de fijar la sonda a la unidad, la impedancia de cada sitio de registro se debe comprobar:
- Sumerja la sonda en 0,9%, y conectarlo a una impedancia metros. Si los sitios de grabación demasiados tienen una impedancia incorrecta, repita los pasos 2.4-2.6 o considerar el uso de una sonda diferente.Aquí se utiliza un módulo de acondicionamiento de Impedancia de Federico Haer, Co. (FHC), combinada con un selector de canales de fabricación casera. Alternativamente, un niPOD por NeuroNexus, Inc. o NanoZ por Neuralynx, Inc. permite la monitorización de la impedancia de todos los canales de la sonda de forma simultánea.
3. Colocación de la sonda al microdrive
- Utilizando una cuchilla de afeitar, cortar ranuras múltiples en el puente para crear una superficie rugosa.
- Aproximar la sonda hasta el puente de la unidad. Este procedimiento se realiza mejor bajo un microscopio quirúrgico, manteniendo la unidad con una pinza y el ajuste de la sonda por un micromanipulador de modo que los vástagos son perfectamente paralelo con el tornillo de accionamiento. Esto asegura que durante el avance, el movimiento de la sonda vástagos en el tejido cerebral sin 'cortar' a través de ella. La profundidad exacta de las puntas de las sondas con relación a la base de la unidad se debe determinar en esta etapa, teniendo en cuenta la profundidad de la estructura de destino de la superficie delcráneo.
- La sonda se fija entonces al puente con cemento agarre.
- Opcional: para la visualización de la pista de la sonda en el cerebro, solución Dil (1-2% diluida en etanol) se puede aplicar a la parte posterior de la sonda en esta etapa.
4. Preparación del cráneo
Antes de la cirugía, los electrodos de referencia y de tierra, y las partes de la jaula de Faraday en la cabeza se preparan:
- Cortar dos piezas 2 "-largos de hilo de cobre y estaño un extremo de cada cable de cobre aislado durante aproximadamente 1 mm.
- Usando una aguja, raspar la cabeza de un 00-90, 1/8 "tornillo de acero inoxidable y la soldadura de una pieza de alambre de cobre a la misma. Soldadura de acero inoxidable tales tierra tornillo-electrodos requiere un flujo adecuado (por ejemplo, N-3 Todos propósito flujo de La-Co) y altas temperaturas punta del soldador. cuidadosamente evitar cualquier soldadura fluya en la ranura del tornillo. Esto será utilizado como el electrodo de tierra. Repetir con otro tornillo y el alambre de cobre para prepararel electrodo de referencia.
- Corte los pedazos trapezoidal de malla de cobre. Estas piezas serán ensamblados para proteger el cabezal de la platina.
Los instrumentos quirúrgicos y la preparación son los mismos tal como se utiliza en muchas de las cirugías de pequeños animales. Toda la cirugía se realiza bajo anestesia con isoflurano profundo, utilizando las condiciones de asepsia, de acuerdo con las directrices aprobadas por el NIH. Tenga en cuenta que la cirugía (simulacro) se muestra en este video es para fines de demostración. Para los fines pertinentes visibilidad y el rodaje, varias medidas preparatorias, las precauciones y procedimientos quirúrgicos postoperatorios no se muestran / visible o discutido.
Antes de la cirugía, todos los componentes y materiales deben ser esterilizados, siguiendo los procedimientos adecuados (véase la Guía de supervivencia para la cirugía de roedores; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Durante la cirugía, un campo estéril en el cráneo está preparado y aislado por paños estériles. Al final de la cirugía, unos antibióticos de amplio espectro es unapplied a nivel local y un analgésico de acción prolongada que se administra por vía intramuscular (por ejemplo, buprenorfina, [Buprenex] 0,05 mg / kg). Además, analgésico (por ejemplo, ibuprofeno) se proporciona en el agua potable a aproximadamente 60 mg/kg/24 horas durante 5 días. Para los procedimientos adecuados de anestésicos y quirúrgicos, consultar la información pertinente 12.
- Instale el animal en el aparato estereotáxico, rasura y limpia el cuero cabelludo 13.
- Cortar la piel a lo largo de la línea media y dejar de lado el cuero cabelludo. Retire el periostio, limpiar y secar el cráneo.
- Mida la ubicación y distancia entre bregma y lambda, y determinar las coordenadas x e y de la zona de implantación de la sonda de acuerdo con un atlas estereotáxico 14. Marcar el sitio raspando una cruz en el cráneo con un bisturí.
- Perforar el cráneo usando un poco la cabeza de perforación redonda (tamaño ¼) y los tornillos de la unidad de apoyo (de acero inoxidable, 000-120, 1/16 ") a mitad de camino en el hueso, en las placas óseas diferentes en la parte superior unª en el lado del cráneo. Los tornillos se ofrecen anclajes para fijar la fianza del casco en el cráneo.
- Perforar agujeros por encima del cerebelo e inserte la tierra y electrodos de referencia preparados en el paso 4.2. Para el registro de potenciales de campo locales (LFP), la elección del sitio de referencia es fundamental. Este sitio se eligió porque LFP cerebelosa es la más pequeña de todas las regiones corticales y artefactos musculares son mínimas en este lugar la línea media.
- Aplicar la dentina activador (Metabond kit) utilizando un pequeño cepillo sobre toda la superficie del cráneo. Enjuague con solución salina al 0,9%.
- Aplique el cemento dental (Metabond kit, siga las instrucciones del fabricante para la mezcla) en el cráneo, cubriendo bien los tornillos de anclaje y el suelo y los electrodos de referencia, pero dejando el sitio de implantación de la sonda claro.
- Fije las aletas de cobre cuatro mallas (preparado en el paso 4.3) en el cráneo. Para ello, consolidar la estrecha base de cada una de ellas a las partes anteriores, izquierda, derecha y posterior del cráneo. Thcobre e nunca debe estar en contacto directo con el hueso pero siempre separados por una capa de cemento.
5. Preparación de la superficie del cerebro
- Usando un poco la cabeza de perforación redonda, perforar alrededor del sitio de implantación en múltiples etapas, mientras que con frecuencia la irrigación del hueso con solución salina.
- Retire con cuidado el colgajo óseo y el riego de la superficie del cerebro.
- Para insertar una sonda de múltiples vástago, una tira de gran duración se elimina. Dos herramientas son necesarias para eliminar la dura: un bisturí y un gancho preparado a partir de una aguja de insectos (como alternativa, un microelectrodo de tungsteno estándar). Doble la punta de la aguja empujando contra una superficie dura (por ejemplo, diapositivas de vidrio para microscopio), y adjuntarlo a un mango (en este caso, un pedazo de madera Q-tip, alternativamente, el titular de microdissecting aguja).
- Levante la duramadre con el gancho, y la cortó con un bisturí. Se tiene especial cuidado para evitar dañar la pia, los vasos y la superficie de la corteza cerebral. Pequeño sangrado puede ser resueltopor la irrigación con solución salina. Si ocurra un sangrado mayor o el neocórtex está comprometida en modo alguno, se debe considerar la terminación de la cirugía y la preparación de otro animal.
6. La implantación de la sonda
En esta etapa, la densidad y la orientación de los vasos superficiales corticales son evaluados cuidadosamente. Coordenadas estereotáxicas se debe ajustar, ya que la sonda tiene que penetrar en el cerebro en un área libre de buques de mayor tamaño.
Para la implantación, el conjunto de la unidad se hace con una pinza unida a la titular de la estereotáxica. Visibilidad ininterrumpida de la superficie del cerebro y las puntas de la sonda son críticos para la penetración exitosa.
- Baje lentamente la sonda hasta aproximadamente 1 mm por encima del objetivo previsto, mientras que el riego constante de la craneotomía con solución salina. Para la grabación de la neocorteza, las puntas de las sondas se bajan en la corteza de aproximadamente 0,5 mm y la levantó de nuevo cerca de la superficie.
- Sellar la craneotomía mediante la aplicación de una mezcla fundida caliente de aceite de parafina y cera a través de una aguja (10-20g de cera en 10 ml de aceite de parafina, se calentó a 65 ° C). Antes de la aplicación, enfriar la mezcla a 30 ° C y probar la densidad. Debe ser lo suficientemente suave para permitir el movimiento de la sonda fácil). Para facilitar la cobertura completa, la mezcla puede ser fundido in situ por acercarse a la cera endurecida con la punta de un cauterizador micro.
- Coloque la parte inferior de la unidad en el cráneo con cemento agarre, teniendo cuidado de dejar la tuerca gire libremente. Es de suma importancia para evitar cualquier accidente "golpe" de la unidad en esta etapa, de lo contrario la sonda puede dañar la corteza. Después de la unidad se fija en el cráneo, el movimiento suave de la sonda debe ser verificado.
- Cemente la parte del conector de la sonda en el cráneo.
7. La construcción de la cabeza en jaula de Faraday
- Tire hacia arriba y montar las tapas de malla de cobre en un cilindro de protección alrededor de la sonda y el drive. El cilindro también sirve como un blindaje eléctrico contra el ruido ambiental y los artefactos de onda lenta producidos por las patillas cargadas en el animal comportarse.
- Ajustar la altura del cilindro cortando el exceso de material por lo que la malla de cobre está a nivel con la parte superior del conector de la sonda.
- Soldar los cables de la referencia y tornillos de tierra a los pines correspondientes del conector. Además de soldadura aletas adyacentes malla de cobre juntos para asegurar su continuidad eléctrica, y soldar el cable de tierra a la malla de cobre.
- Aplicar una capa de cemento agarre sobre la malla de cobre para reforzarla y para evitar cualquier contacto directo entre el metal y la piel del animal. Si lo desea, aplique una capa de resina epoxi para reforzar aún más el casco.
- Probar el movimiento del tornillo de accionamiento.
- Cubrir la parte superior del casco con un corte pieza de un guante de caucho.
8. Grabación en el animal que se mueve libremente
- Después de aprocomió cuidados post-operatorios, conecte el animal con el sistema de grabación mediante un cabezal de alta impedancia y un cable ligero y ultraflexible multi-hilo. Contrarrestar el peso del casco.
- Pon a prueba la calidad de la grabación de cada día en el homecage. La posición de los sitios de grabación se juzga por ambos patrones de unidad de disparo y la forma de los potenciales de campo local. Bajar la sonda gradualmente haciendo girar el tornillo en pequeños incrementos (típicamente 1/8 a 1/4 vuelta por día, es decir, 35-70 micrómetros) hasta que la estructura objetivo se alcanza.
9. Los resultados representativos
Señales electrofisiológicas (potenciales de campo local y la actividad de la unidad) varían dependiendo de la estructura de grabado y el comportamiento actual de los animales. La figura 1 muestra ejemplos de 32 canales de CA1 del hipocampo de las grabaciones, mientras que la rata está explorando un campo abierto. Nótese la prominente 8 Hz (theta banda) de oscilación del potencial del campo local durante la exploración con apoyoerimposed adición de espigas y sitios (por ejemplo de los picos indicados por puntas de flecha). Para analizar la actividad de la unidad neuronal, los picos se detectan y se clasifican en unidades individuales mediante el análisis conjunto de sus formas de onda 15-16.
Figura 1. CA1 del hipocampo en las grabaciones de la rata comportarse con una 4 x 8 vástagos de los sitios de la sonda de silicio. Las grabaciones son de banda ancha y la muestra a 20 000 Hz, lo que permite estudiar tanto las oscilaciones de campo locales potenciales (por ejemplo, "zeta" banda de 8 ritmo Hz) y un rápido aumento de la actividad neuronal.
Tabla 1. Las alternativas a los reactivos y el equipo utilizados.
