Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Summary

Objetivos múltiples de seguimiento es un algoritmo desarrollado para el seguimiento de fabricación casera individualmente moléculas marcadas dentro de la membrana plasmática de las células vivas. De manera eficiente la detección, la estimación y el seguimiento de las moléculas a través del tiempo en la alta densidad proporcionan un fácil de usar, herramienta completa para investigar la dinámica de la membrana a nanoescala.

Abstract

Nuestro objetivo es obtener una descripción completa de los procesos moleculares que ocurren en las membranas celulares de diferentes funciones biológicas. Nuestro objetivo es la caracterización de la organización compleja y dinámica de la membrana plasmática en una sola molécula de nivel, mediante el desarrollo de herramientas analíticas dedicadas a una sola partícula de seguimiento (SPT) en alta densidad: Múltiples-Objetivo de Búsquedas (MTT) ^1. Una sola molécula de videomicroscopía, ofreciendo milisegundos y resolución nanométrica ^1-11, permite una representación detallada de la organización de la membrana ^12-14 con precisión la cartografía descriptores tales como la localización de los receptores de la célula, la movilidad, el parto o interacciones.

Volvimos a visitar el SPT, tanto a nivel experimental y algorítmicamente. Aspectos experimentales incluyeron la optimización de la configuración y el etiquetado de células, con un énfasis particular en alcanzar la densidad de etiquetado más alto posible, a fin de proporcionar una instantánea dinámica de una dinámica moleculars que se produce dentro de la membrana. Problemas algorítmicos en cuestión cada paso utilizado para la reconstrucción de las trayectorias: la detección de picos, la estimación y la reconexión, se dirigió a las herramientas específicas de análisis de imagen ^15,16. Implementación de la deflación después de la detección permite que los picos rescate oculto inicialmente por los picos vecinos, más fuertes. Es de destacar que la mejora de la detección de un impacto directo en la reconexión, por la reducción de las diferencias dentro de las trayectorias. Las presentaciones han sido evaluadas utilizando simulaciones de Monte Carlo para la densidad de etiquetado diferentes y los valores de ruido, que normalmente representan las dos principales limitaciones de las mediciones paralelas con una resolución espacial y temporal de alta.

La precisión nanométrica ¹⁷ obtenido por moléculas individuales, usando ya sea sucesiva de encendido / apagado óptica photoswitching o no lineal, puede entregar observaciones exhaustivas. Esta es la base de los métodos de Nanoscopia ¹⁷ como TORMENTA ^18, PALM ^{19,20, 21} o RESOLFT STED ^22,23, WHICH menudo pueden requerir muestras de imágenes fijas. La tarea principal es la detección y estimación de los escasos picos de difracción que emanan de una sola molécula. Por lo tanto, proporcionar las hipótesis adecuadas, tales como el manejo de una precisión de posicionamiento constante en lugar del movimiento browniano, el MTT es francamente adecuado para el análisis de nanoscópicos. Además, MTT fundamentalmente se puede utilizar en cualquier escala: no sólo para las moléculas, sino también para las células o animales, por ejemplo. Por lo tanto, MTT es un algoritmo de seguimiento de gran alcance que tiene aplicaciones a escala molecular y celular.

Protocol

En este video, se presenta un solo experimento completo rastreo de partículas, utilizando los puntos cuánticos dirigidos a un receptor de membrana específico. El objetivo principal de este experimento consiste en la discriminación de los diferentes tipos de comportamientos de la difusión molecular de medición dentro de la membrana plasmática de las células vivas. En efecto, los movimientos moleculares que surgen en la membrana típicamente puede desviarse de difusión browniano al ser linealmente dirigido o confinado dentro nanodomains ^26-29, por ejemplo. Nuestro objetivo es al mismo tiempo después de que muchos receptores como sea técnicamente posible, para proporcionar una instantánea de la variedad que surge en la dinámica que ocurren dentro de la membrana de una célula viva. Esto es en última instancia, espera que permita descifrar los mecanismos que regulan la señalización celular de los receptores de la superficie.

1. Cultivo Celular

1. Preparar la muestra de células: el uso adherentes células COS-7, que expresan el receptor de forma endógena del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ^30. Cuandotrabajar con células vivas, sin antibióticos, asegúrese de no tener latencia sub-detectable la contaminación mediante el uso de técnicas adecuadas de estériles en todo momento durante la preparación.
2. Se cultivan las células en medio completo (DMEM con suero de ternera al 10%, 1% de glutamina, HEPES 1% y 1% de piruvato sódico, véase la tabla de reactivos específicos a continuación), a 37 ° C con 7% de CO _2, teniendo cuidado de tener en ellos sub-confluentes, el crecimiento exponencial antes de extenderse en Lab-Tek.
3. El día antes del experimento, se extendió 5.000 células / pocillo en 8 y cámaras (Lab-Tek) y se incuba durante la noche. Contando células asegura una densidad celular constante, por lo tanto una relación reproducible de cuántica puntos por celda.

2. Etiquetado de la célula

Preparar cuánticos-puntos con un recubrimiento específico. Quantum-puntos son nanopartículas fluorescentes compuestos de semiconductores. Estas nanopartículas presentan un gran interés debido a que son muy brillantes y fotoestable en comparación con el clásicosondas fluorescentes ^31,32, lo que permite el logro de una señal apropiada a ruido (SNR) para obtener imágenes de una sola molécula.

1. Antes del experimento, producir fragmentos Fab contra EGFR de la línea celular de hibridoma (AcMo 108, ATCC HB 9764), mediante digestión con papaína como se ha descrito previamente ^21.
2. Conjugado con biotina Fab, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (EZ-Link sulfo-NHS-LC-kit de biotinilación, Thermo Scientific, Fig. 1A)..
3. Utilizar cuántica puntos funcionalizados con estreptavidina (Invitrogen) y emisor a 605 nm (longitud de onda de emisión óptima para la brillantez, la detección y separación de autofluorescencia celular).
4. Preparar la solución de etiquetado en medio completo (véase la tabla de los reactivos específicos), con el fin de saturar las streptavidins presentes alrededor de los puntos cuánticos, así como para prevenir la agregación y la unión no específica a las células y al cubreobjetos.
5. Preparar dos soluciones intermedias:uno con los puntos cuánticos-estreptavidina y otro con biotina Fab, cada uno a 20 Nm.
6. Mezclar un volumen igual de estas dos soluciones: mezclar los puntos cuánticos con Fab en proporción de 1:1 para obtener una concentración final de trabajo de 10 nM Fab: cuánticos-puntos complejo. Usando una relación equimolar favorece la formación de mono-funcionalizados complejos compuestos por un puntos cuánticos y un fragmento Fab biotinilado. Esto favorece el etiquetado monovalente, limitando observaciones artefactos debidos a los receptores de reticulación ^33,34.
7. Incubar durante 15 minutos a 25 ° C, utilizando un agitador a 1.200 revoluciones por minuto para evitar la agregación. La mezcla es entonces listo para su uso en células vivas.
8. Se incuban las células en 100 l de mezcla durante 5 minutos a 37 ° C con 7% de CO _2.
9. Lavar las células con medio de imágenes no autofluorescente (tampón HBSS, HEPES 1%, ver tabla de reactivos específicos) previamente calentada a 37 ° C.
10. Retire con cuidado el exceso de etiquetas para evitar que las Naciones Unidasnecesario estropear la SNR por no unido, fuera de foco cuánticos-puntos, por lavado extensivamente cada pocillo con medio formador de imágenes, típicamente 5 veces a temperatura ambiente, con al menos 5 minutos antes de retraso del último lavado.

3. Configuración óptica

La configuración de video-microscopía se compone de cuatro partes principales:

1. Un microscopio invertido con un cubo específico de fluorescencia (FF01-457/50 excitación, dicroico FF495-DI02, y FF01-617/73 filtros de emisión, Semrock) y una gran apertura numérica (1,3 o 1,49) de inmersión en aceite objetivo 100x.
2. Una lámpara de mercurio de 100 W (acoplado al microscopio a través de una fibra óptica, evitando interferir con la termorregulación).
3. Una sensibilidad de 512 x 512 píxeles de alto EMCCD la cámara para obtener una buena relación señal ruido.
4. Una incubadora para mantener las muestras biológicas a 37 ° C durante el experimento.

4. Adquisición

1. Seleccione las celdas aisladas y bien extendido. Estefavorece la extensión de lamellipodia bonito, plano, que mejor se adapte a buscar movimiento plano de las moléculas de la membrana.
2. Evaluar el estado fisiológico celular por su apariencia, tanto en la luz transmitida y fluorescencia: el tráfico vesicular intensa, ausencia de signos de necrosis o apoptosis, la autofluorescencia de baja y media-fuerte de puntos cuánticos de etiquetado (por lo general hasta 1.000 cuántica puntos por celular, ver fig. 1B, C).
3. Seleccione una densidad de etiquetado de alto, que es fundamental para el seguimiento al mismo tiempo receptores de la mayor cantidad posible. Esto es realmente limitado tanto por fisiológica (expresión en la superficie, la accesibilidad epítopo, el movimiento lateral) y los parámetros de algoritmos (no superposición de funciones de cálculo de punto (PSF), incluso teniendo en cuenta borrosa debido al movimiento, para permitir la detección adecuada y reconexión).
4. Para cada celda, primero adquirir una imagen de campo campo claro (preferentemente utilizando DIC, si está disponible) que además puede permitir la comprobación de la célula aspectoy los límites espaciales de la lamellipodia.
5. Guarda esta imagen con el mismo nombre que el video-pila (como cell1.tif y cell1.stk por ejemplo), en una subcarpeta denominada CID, ya que, con estos convenios, el algoritmo de forma automática se puede encontrar de nuevo la imagen correspondiente para cada pila.
6. Adquirir 1 a 3 videos por celular, de forma continua, por lo general a los 36 ms de tasa, la tasa más alta alcanzable en el fotograma completo con esta cámara. Sin embargo se puede adquirir a frecuencias más altas, de hasta 1-ms tasa, utilizando CCD dedicado con aumento de la sensibilidad y / o menos pixeles. La tecnología proporciona el marco de transferencia de retraso insignificante entre los marcos.
7. La mejora de electrones se multiplican siempre debe estar al máximo (justo debajo de la saturación, en su caso) para permitir alcanzar la sensibilidad sola molécula, con un número suficiente de SNR, por lo menos por encima de 20 dB (para la detección eficaz de pico ^1), por lo general alrededor de 25-30 dB.
8. Por lo general adquieren 300 imágenes por vídeo, el pecadoce se reconstruyen las trayectorias de más de ~ 100 marcos, en promedio, en su mayoría limitados por largos eventos parpadeo. La frecuencia y la duración del vídeo se puede adaptar para una acción determinada, lo cual podría requerir más rastros, por ejemplo.

5. MTT Análisis

1. Seleccione la ruta al directorio que contiene los archivos de video para evaluar un determinado conjunto de datos con Matlab u Octave.
2. Para iniciar el análisis totalmente automatizado ^1,35, escriba el comando detect_reconnex23 en Octave, o MTT23i en Matlab. Este programa representa "la versión 2.3, con interfaz de usuario" y está disponible para su descarga, junto con la versión anterior 2.2. En primer lugar, muestra un interfaz gráfico listado de todos los parámetros utilizados, como se muestra en la fig. 2.

6. Los resultados representativos

MTT analiza automáticamente cada grabadora de vídeo, para entregar las huellas de los objetivos detectados y estimados, complementados por más devestigaciones, como la detección de confinamiento. En última instancia, permite que las huellas de mapeo sobre las imágenes de células (Fig. 1C y 3).

Descripción MTT

El análisis de MTT núcleo se realiza sobre cada fotograma, invocando 3 tareas principales (Fig. 3):

1. La detección de la presencia o ausencia de un objetivo (puntos cuánticos), dentro de un deslizamiento subregión sucesivamente centrado alrededor de cada píxel, donde se comparan dos hipótesis: o bien la presencia de una señal, con el PSF modelizado como un pico bidimensional gaussiana , o sólo el ruido, con un umbral bajo de falsas alarmas asegurar suficiente, con menos de una detección de falsos por cuadro. Esto conduce a un mapa de probabilidad de detección. Cada máximo local se considera como un objetivo putativo, asegurando que su nivel de probabilidad es mayor que un valor mínimo, fijado de acuerdo con la probabilidad deseada de falsa alarma (PFA). Este límite se fija lo suficientemente bajo como para discriminar de manera eficiente SIGnales de ruido, evitar en el mejor de detecciones espurias (PFA de 10 ^-6 por defecto, para asegurar que menos de un error en 512 x 512 imágenes de píxeles), al tiempo que permite una probabilidad suficientemente alta de detección, llegando a la teoría predice ^un óptimo. Tenga en cuenta que el requisito de utilizar una sub-región implica que los bordes de la imagen (3 píxeles, por un defecto de la ventana de 7 x 7 píxeles) no se puede evaluar.
2. Estimación, para cada objetivo detectado, de los parámetros pertinentes, como sub-píxel posición e intensidad de la señal. Por cada objetivo detectado, una de los mínimos cuadrados de Gauss-Newton ajuste se realiza próxima para estimar la posición, anchura y altura de la gaussiana detectado. Esto permite en particular la posición de sub-píxel del medio de contraste (10 a 20 nm para la precisión de los valores típicos de SNR y tintes inmóviles o difundir lentamente, aumentando hasta ~ 100 nm para la difusión de los colorantes a 0,1 m ^{2 /} s).
3. Reconexión de los nuevos objetivos con elhuellas ya construido en los fotogramas anteriores. El conjunto de nuevos objetivos se corresponde con el conjunto de restos anteriores. Para este propósito, a fin de asignar a cada objetivo a una huella, si es posible, toda la información disponible estadística obtenida de la etapa de detección se utiliza, no sólo la posición, pero también intensidad, ancho, parpadeando y las estadísticas asociadas. Por lo tanto, los objetivos no sólo están asignados a la más cercana de seguimiento: en el caso de los rastros que cruzan, la intensidad, la velocidad, el ancho y el parpadeo se tendrán en cuenta. Esto ofrece la puntuación de reconexión estadísticamente óptimo. Esta estrategia evita, siempre que sea posible, la reconexión de polarización hacia los vecinos más cercanos.

Picos detectados a posteriori puede ser rechazada si su estimación o reconexión falla. Un examen especial se encarga de la detección de nuevos picos, que iba a iniciar nuevas trazas. Esta prueba utiliza un más estricto de PFA (10 ^-7), ya que volver a conectar un máximo de un rastro puede ser interpretado de facto como la validación o f su importancia (este criterio es, por definición, no es aplicable para nuevos picos).

Trayectoria Análisis

Confinamiento transitoria Posible está próximo evaluada por una función inversamente relacionada con la difusión local ^24-29. La aplicación de un umbral permite definir limita o no episodios. Al iterar sobre ellos todos los rastros, podemos trazar la dinámica de la membrana, en términos de reclusión transitoria / frenar los acontecimientos. Esto puede ser alternativamente representada utilizando el binario o valores discretos de este índice confinamiento.

De forma predeterminada, MTT realiza automáticamente las tareas, el ahorro de 8 parámetros máximos en un archivo de texto: el número de fotograma, i y la posición j, intensidad de la señal, el radio, que se compensan y parpadear, para cada fotograma de vídeo (grupo de 7 filas) y trace (columna) . Estos parámetros pueden ser recargadas en Matlab u Octave usando el script fread_data_spt para un análisis posterior de las huellas es decir, o intensidad de la señal, como se ejemplifica en el "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example secuencia de comandos en el apéndice.

Otros análisis conducen a trazar huellas en cada celda (Fig. 1C y 3) y para proporcionar una distribución del histograma para los parámetros pertinentes, como el pico de intensidad, SNR o valores locales de difusión). Para cada archivo, media y desviación estándar de cada parámetro se guardan en un archivo de texto, junto con una imagen de los histogramas. Distribuciones logarítmicas, como para los desplazamientos cuadrados r ^2, conducir a la media geométrica. El coeficiente de difusión D se calcula a partir de un ajuste lineal durante los cinco primeros puntos de la curva de MSD. Estos valores proporcionan una visión general de un experimento relacionado con la cinética de las reacciones celulares ejemplo o tratamientos farmacéuticos / enzimáticos que afectan a la organización de la membrana. Desde MTT es un código de fuente abierta, este aspecto puede ser fácilmente adaptado a cualquier investigación dedicada.

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Figura 1. Seguimiento receptores de membrana dinámica por MTT. (A) los componentes de membrana, tales como el EGFR, se marcan con puntos cuánticos acoplados a los fragmentos Fab biotinilado (dibujo esquemático con escala aproximadamente correcta de cada molécula). (B) imagen fluorescente típica adquirida a partir de un en vivo de células COS-7, con el tiempo de exposición de 36 ms, que representa difracción limitada picos correspondientes a los receptores etiquetadas individualmente. (C) de salida del análisis MTT mostrando las trayectorias reconstituidas de los receptores, superpuesta a la imagen campo claro de la célula.

Figura 2. MTT parámetros de entrada. Ejecución MTT23i abre una interfaz gráfica de usuario lista de todos los parámetros de entrada, los nombres y los valores predeterminados, como se describe en nuestra publicación anterior ^1. En los parámetros del algoritmo, espacio y tiempo (ventanas de búsqueda, el radio máximo, la máxima difusión y parpadeando) se encuentran en unidades adimensionales estándar, los píxeles y los marcos. Las calibraciones se pueden aplicar a posteriori, para convertir los resultados de salida. Los valores por defecto, lo que corresponde a una cascada 512BFT con un aumento de 100x, son píxeles Tamaño: 156 nm / pxl y la demora de fotogramas: 36 ms / frame.

Los investigadores deben optimizar algunos parámetros críticos, tales como el coeficiente de difusión máxima esperada ("Diff máximo") y la desaparición intermitente máximo ("T _off"). Estos dos límites de espacio y tiempo son casi los únicos que necesitan ser modificadas para una determinada condición experimental, los otros que se establecen en valores predeterminados robustos. Por ejemplo, el número de falsas alarmas se fija directamente a asegurar menos de un error por cada millón de pixeles, por lo tanto, menos del uno por cuadro, que es satisfactoria en la mayoría de los casos. Todos los parámetros se guardan en un archivo de texto en la carpeta de salida, permitiendo que los usuarios puedan comprobar a posteriori los ajustes que se utilizaron para su análisis.

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Figura 3. Los pasos principales del análisis MTT. A partir de una pila experimental de imágenes de fluorescencia, los picos son secuencialmente y detecta automáticamente, estimado por un ajuste gaussiano y vuelto a conectar más de marcos (primera gama de operaciones, parte superior del diagrama de flujo). Trazas adicional puede ser analizado para el confinamiento putativo, por ejemplo, conduciendo finalmente a un mapa dinámico de descriptores pertinentes (segunda gama de operaciones, parte inferior).

Figura 4. Etiquetado de valencia no tiene impacto en MTT. Para evaluar el posible sesgo introducido por medio del etiquetado multivalente artefactual, el análisis MTT se llevó a cabo para realizar un seguimiento de EGFR endógeno etiquetados con 2 esquemas diferentes, para generar y analizar mapas de trayectorias. (A) Los receptores fueron marcados con biotina Fab y cuántica dots605 estreptavidina, tal como se describe en el protocolo.En este caso, la valencia de varios de los puntos cuánticos y streptavidins puede resultar en varios receptores de acoplamiento a un solo colorante. (B) Los receptores fueron marcados con Fab directamente acoplado a un colorante orgánico, Atto647N. En este caso, un Fab, por lo tanto, un receptor, puede ser acoplado a más de un colorante. (C) La media de desplazamiento cuadrado (MSD) la curva se calculó para todos los rastros de cada celda, con la etiqueta, ya sea con puntos cuánticos como los tintes y Atto (gráficos de izquierda y derecha, respectivamente). Los coeficientes de difusión se calcula en forma lineal a lo largo de los cinco primeros puntos de la MSD (línea roja punteada). Cada sistema de etiquetado llevado a los valores de difusión similares (gráfico central). Qdot: cuántica dots605 (n = 5 células), Atto: Atto647N (n = 7 células), ns: no significativo (t de Student test valor p> 0,05).

Discussion

En una sola partícula de seguimiento, junto a los aspectos celulares y microscopía, el análisis representa una parte sustancial de la obra. Esto se dirige el algoritmo utilizado para realizar las tres tareas principales: la detección, la estimación y volver a conectar picos de más de cada fotograma. Pero el aspecto consecuente de este trabajo reside en la elaboración del propio algoritmo, que puede ser necesario adaptar a cualquier nueva investigación dedicada, fundamentalmente por los últimos pasos, extra (como descifr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo	Empresa	Número de catálogo	Cantidad
Cos-7 línea celular	ATCC	CRL-1651	5.000 células por pocillo
HBSS sin Ca 2 +	GIBCO	14175	1 ml
0,05% de tripsina EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-así Lab-Tek	NUNC	155441	1
Qdot-605 estreptavidina	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Fab biotinilado (para la síntesis de los fragmentos Fab, véase la referencia 21)
Fab del AcM 108	ATCC	HB-9764	200 g
NHS-biotina	Thermo Scientific	21435	18,5 g
Completar medio
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Suero Bovino Fetal	SIGMA	F7524	50 ml
L-glutamina	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Piruvato de sodio	GIBCO	11360	5 ml
Imagen mediana
HBSS con Ca 2 +	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 l